miR-122-5p靶向KDM2A對骨髓間充質干細胞成骨分化的影響*

徐捷 彭昊 萬龍彪 劉豐

骨質疏松癥是一種常見的代謝性骨病，其臨床特征主要是骨量減少和骨微觀結構的破壞。研究發現，骨質疏松患者發生骨折的概率較健康人群顯著增加，嚴重危害患病人群的生活質量[1-2]?，F有研究普遍認為，骨質疏松的主要原因是骨吸收和骨形成之間的平衡被打破，導致骨量減少。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）是一類來源于中胚層的干細胞，具有多向分化的能力[3]。研究表明，BMSC成骨分化能力減弱是骨質疏松的重要發病機制[4]。因此，促進BMSC成骨分化以糾正骨代謝平衡是治療骨質疏松癥的潛在方式之一。

microRNA（miRNA）屬于小RNA家族，長度為18 ～ 25個核苷酸。miRNA能夠特異性結合下游靶基因，抑制其蛋白翻譯，進而調控細胞增殖、分化和凋亡等生理和病理過程[5]。研究表明，miRNA在骨代謝平衡中也發揮重要作用。目前，已發現多種miRNA能夠通過促進或抑制BMSC成骨分化進而影響骨量的形成[6]。以往研究表明，miR-122-5p廣泛參與各項生理病理過程，如Circ_LRP6和HMGB1競爭性結合miR-122-5p參與調控骨肉瘤的進展[7]，miR-122-5p通過介導TGF-β1和ATG5之間的負反饋回路參與調控細胞纖維化[8]。除此之外，研究表明，miR-122-5p是骨質疏松癥的潛在診斷生物標志物，骨質疏松癥患者血清中miR-122-5p表達水平顯著降低[9]。然而，miR-122-5p在骨質疏松發病機制中的調控作用尚不清楚，尤其是對BMSC成骨分化的影響尚未見報道。此外，研究表明組蛋白去甲基化酶2A（histone demethylation protein 2A,KDM2A）在多種疾病中發揮重要的調控作用。Deng等[10]的研究發現，KDM2A通過上調SOX2和NANOG表達促進牙源性干細胞向成脂方向分化，進而影響牙源性干細胞成骨/成脂分化平衡。但KDM2A對人BMSC成骨分化的影響卻鮮有報道。因此，本實驗以BMSC為研究對象，探討miR-122-5p對KDM2A的調控作用，以及兩者對BMSC成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞

人骨髓間充質干細胞購于西安捷晶生物技術有限責任公司。

1.2 主要試劑

MEM基礎培養基（12571063）、胎牛血清（12483020）和胰蛋白酶（25200056）均購于美國Gibco公司。成骨分化培養基（HUXMX-90021）購于中國賽業生物科技公司。miR-122-5p mimic，miR-122-5p inhibitor，miR-NC，過表達KDM2A質粒（OE-KDM2A）和空白對照（OE-NC）由中國廣州銳博生物技術有限公司合成。茜素紅染色試劑盒（C0138），BCⅠP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒（C3206）和雙螢光素酶檢測試劑盒（RG088S）均購自中國碧云天公司。OPN（25715-1-AP）、RUNX2（82636-2-RR）、ALP（11187-1-AP）、KDM2A（24311-1-AP）和GAPDH（10494-1-AP）兔多克隆抗體以及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔ⅠgG二抗（SA00001-2）購于武漢三鷹生物科技有限公司。

1.3 細胞培養和轉染

人BMSC培養于含10%胎牛血清的MEM培養基中，細胞在37℃，5%CO2細胞培養箱中培養。當細胞密度達到80% ～ 90%時，PBS沖洗細胞3次，每次2 min，1 mL胰蛋白酶消化細胞1 ～ 2 min，隨后用2 mL MEM培養基終止消化，將細胞懸液于15 mL離心管中離心，最后將細胞分別接種于6孔板中，當BMSC融合率達到80% ～ 90%時，利用Lipofectamine 2000試劑轉染細胞，分組為：miR-NC組、miR-122-5p mimic組、OE-NC組、OE-KDM2A組和OE-KDM2A+ miR-122-5p mimic組。

1.4 qRT-PCR檢測miR-122-5p和成骨基因表達情況

利用Trizol裂解細胞，加入氯仿抽提RNA，最后加入異丙醇沉淀RNA，離心后用75%乙醇洗滌RNA，晾干后利用酶標儀測定RNA濃度。利用Takara反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，將提取的RNA與各種試劑混勻后進行反轉錄，反應條件為：37℃ 15 min，85℃ 5 s。利用Takara擴增試劑盒檢測miR-122-5p以及成骨相關基因（OPN、ALP和RUNX2）的表達情況，將cDNA與Takara試劑盒中的試劑按照相應配比混勻，反應條件為：98℃ 10 s，55℃ 5 s，71℃ 1 min，30 ～ 50 cycles。其中U6和GAPDH分別為miR-122-5p和成骨基因的內參。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 Western blot檢測蛋白表達水平

利用RⅠPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白（電泳條件：80 V 30 min，120 V 60 min），隨后將蛋白轉移至PVDF膜上（轉膜條件：400 Ma 40 min），5%脫脂牛奶封閉后，4℃條件下過夜孵育一抗，TBST清洗PVDF膜，室溫條件下孵育二抗1 h，最后使用ECL發光液曝光顯影條帶。

1.6 茜素紅染色檢測鈣沉積情況

將轉染后的BMSC在MEM培養基條件下培養2 d，隨后將MEM培養基更換為成骨誘導培養基，培養期間每2天換液1次，2周后使用4%多聚甲醛固定20 min，茜素紅染色30 min，去離子水清洗去除多余染液后，于顯微鏡下拍照觀察。使用十二烷基硫酸鈉溶解鈣結節，檢測405 nm處的吸光度用于定量分析鈣沉積情況。

1.7 堿性磷酸酶染色檢測酶活性

將轉染后的BMSC在MEM培養基條件下培養2 d，隨后將MEM培養基更換為成骨誘導培養基，培養期間每2天換液1次，1周后使用4%多聚甲醛固定20 min，使用BCⅠP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑染色20 min，PBS清洗去除多余染液后于顯微鏡下拍照觀察。使用堿性磷酸酶檢測試劑盒測定410 nm處吸光度用于定量分析堿性磷酸酶活性。

1.8 雙熒光素酶報告試驗

使用TargetScan在線數據庫預測KDM2A和miR-122-5p相互結合位點，分別構建野生型（WT）和突變型（MUT）3'-UTR熒光素酶表達質粒，將BMSC按照1.3中的方法接種于6孔板中，待BMSC融合率達到80% ～ 90%時，將上述質粒分別與miR-122-5p mimic和miR-122-5p NC共同轉染至BMSC中，48 h后測定熒光素酶活性。

1.9 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，三組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-122-5p影響BMSC成骨分化

首先，使用qRT-PCR方法檢測miR-122-5p在BMSC成骨誘導分化前后的表達情況，結果顯示miR-122-5p的表達水平在BMSC成骨誘導后顯著上調（P＜0.05，見圖1A），提示miR-122-5p可能參與調控BMSC成骨分化。隨后，使用miR-122-5p mimic進一步探討miR-122-5p在BMSC成骨分化中的作用。qRT-PCR和Western blot結果顯示，與miR-NC組相比，miR-122-5p mimic顯著上調成骨相關指標（OPN、ALP和RUNX2）在基因和蛋白水平上的表達水平（P＜0.05，見圖1B、C）。茜素紅染色及定量分析顯示，與miR-NC組相比，miR-122-5p mimic組BMSC細胞鈣沉積水平顯著升高，（P＜0.05，見圖1D、E）。堿性磷酸酶染色及定量分析顯示，miR-122-5p mimic組BMSC細胞鈣沉積水平顯著高于miR-NC組（P＜0.05，見圖1F、G）。

圖1 miR-122-5p影響BMSC成骨分化：A. qRT-PCR方法檢測miR-122-5p在BMSC成骨誘導分化前后的表達情況；B. qRT-PCR檢測miR-122-5p mimic對BMSC成骨相關指標（OPN、ALP和RUNX2）在基因水平上的表達水平；C. western blot檢測miR-122-5p mimic對BMSC成骨相關指標（OPN、ALP和RUNX2）在基因水平上的表達水平；D. 茜素紅染色檢測miR-122-5p mimic對BMSC鈣沉積的影響；E. 鈣沉積的定量分析；F. 堿性磷酸酶染色檢測miR-122-5p mimic對BMSC堿性磷酸酶活性的影響；G. 堿性磷酸酶活性的定量分析

2.2 miR-122-5p靶向調控KDM2A

Targetscan在線數據庫顯示miR-122-5p和KDM2A之間存在特異性結合位點（見圖2A）。雙熒光素酶報告基因顯示，miR-122-5p mimic+KDM2A-WT組的螢光素酶相對活性顯著低于miR-122-5p NC+KDM2A-WT組，而miR-122-5p mimic+KDM2A-MUT和miR-122-5p NC+KDM2A-MUT兩組的螢光素酶相對活性無顯著變化（見圖2B），提示miR-122-5p和KDM2A能夠靶向結合。Western blot結果顯示，與miR-NC組相比，miR-122-5p mimic能夠抑制KDM2A蛋白表達水平，而miR-122-5p inhibitor能夠上調KDM2A蛋白表達水平（見圖2C）。

圖2 miR-122-5p靶向調控KDM2A：A. Targetscan在線數據庫預測miR-122-5p和KDM2A特異性結合位點；B. 雙熒光素酶報告實驗檢測miR-122-5p和KDM2A相互結合關系；C. Western blot實驗檢測miR-122-5p對KDM2A蛋白表達水平的影響

2.3 KDM2A影響BMSC成骨分化

qRT-PCR和Western blot結果顯示，與si-NC組相比，si-KDM2A顯著上調成骨相關指標（OPN、ALP和RUNX2）在基因和蛋白水平上的表達水平（P＜0.05，見圖3A、B）。茜素紅染色及定量分析顯示，與si-NC組相比，si-KDM2A組BMSC細胞鈣沉積水平顯著升高（P＜0.05，見圖3C、D）。堿性磷酸酶染色及定量分析顯示，si-KDM2A組BMSC細胞鈣沉積水平顯著高于si-NC組（P＜0.05，見圖3E、F）。

圖3 KDM2A影響BMSC成骨分化：A. qRT-PCR檢測si-KDM2A對BMSC成骨相關指標（OPN、ALP和RUNX2）在基因水平上的表達水平；B. Western blot檢測si-KDM2A對BMSC成骨相關指標（OPN、ALP和RUNX2）在基因水平上的表達水平；C. 茜素紅染色檢測si-KDM2A對BMSC鈣沉積的影響；D. 鈣沉積的定量分析；E. 堿性磷酸酶染色檢測si-KDM2A對BMSC堿性磷酸酶活性的影響；F. 堿性磷酸酶活性的定量分析

2.4 miR-122-5p靶向KDM2A影響BMSC成骨分化

qRT-PCR和Western blot結果顯示，與miR-NC組相比，miR-122-5p mimic顯著下調成骨相關指標（OPN、ALP和RUNX2）在基因和蛋白水平上的表達水平，而OEKDM2A能夠逆轉miR-122-5p mimic對成骨相關基因的抑制作用（P＜0.05，見圖4A、B）。茜素紅染色及堿性磷酸鎂染色分析顯示，與miR-NC組相比，miR-122-5p mimic顯著抑制BMSC細胞中鈣沉積情況和堿性磷酸酶活性，而OE-KDM2A能夠逆轉miR-122-5p mimic的抑制作用（P＜0.05，見圖4C-F）。

圖4 miR-122-5p靶向KDM2A影響BMSC成骨分化：A. qRT-PCR檢測OE-KDM2A和miR-122-5p mimic共轉染對BMSC成骨相關指標（OPN、ALP和RUNX2）在基因水平上的表達水平；B. Western blot檢測OE-KDM2A和miR-122-5p mimic共轉染對BMSC成骨相關指標（OPN、ALP和RUNX2）在基因水平上的表達水平；C. 茜素紅染色檢測OE-KDM2A和miR-122-5p mimic共轉染對BMSC鈣沉積的影響；D. 鈣沉積的定量分析；E. 堿性磷酸酶染色檢測OE-KDM2A和miR-122-5p mimic共轉染對BMSC堿性磷酸酶活性的影響；F. 堿性磷酸酶活性的定量分析

3 討論

人體骨骼系統始終處于骨形成和骨吸收的動態平衡之中。當這種骨代謝的平衡關系被打破后，就會導致骨量丟失、骨穩定性下降和骨脆性的風險增加，最終導致骨質疏松癥[11]。成骨細胞是主要由間充質干細胞分化而來的骨形成細胞。成骨細胞可以特異性分泌骨基質，在骨形成和重建中發揮關鍵的調節作用[12]。在骨質疏松癥中，BMSC成骨分化能力減弱會加重骨質疏松癥的進展，而恢復BMSC成骨分化能力則能夠延緩疾病進展。例如，芝麻脂素能夠通過直接促進BMSC成骨分化來延緩骨質疏松的進展[13]。除了藥物治療，從基因水平調控干細胞成骨分化能力也是一種具有發展前景的治療方式。越來越多的研究表明，miRNA通過轉錄后調控基因表達情況，進而參與調控多種病理生理過程。隨著研究的深入，人們發現miRNA在調控骨質疏松進展中發揮著重要作用。例如，Li等[14]發現過表達miR-149-3p能夠促進干細胞成骨分化，是骨質疏松癥潛在的治療靶點。Yin等[15]揭示miR-215-5p通過靶向XⅠAP調節干細胞成骨分化和骨質疏松癥的進展。以上結果提示，miRNA能夠通過調控干細胞成骨分化緩解骨質疏松癥的進展。

miR-122-5p已被發現廣泛參與調控各種疾病，包括腹膜纖維化、肺損傷以及腫瘤的發生與發展。例如，miR-122-5p通過靶向Smad5激活Wnt/β-連環蛋白途徑促進腹膜纖維化[16]。miR-122-5p通過靶向ⅠL1RN減輕脂多糖誘導的急性肺損傷[17]。在骨科領域，miR-122-5p已被證實與骨肉瘤細胞的遷移和增殖相關。值得注意的是，對于miR-122-5p在骨質疏松癥中的研究僅有少量報道，且以往的研究僅發現miR-122-5p在骨質疏松癥患者血清中的表達水平顯著降低，是骨質疏松癥的潛在診斷生物標志物[9]。然而，miR-122-5p在骨質疏松發病機制中的調控機制尚不清楚，尤其是對BMSC成骨分化的影響尚未見報道。在此基礎之上，本研究著重探討miR-122-5p對BMSC成骨分化的影響。通過體外實驗發現，miR-122-5p能夠促進BMSC成骨基因的表達、鈣沉積及堿性磷酸酶的活性，提示miR-122-5p參與調控BMSC成骨分化。

研究表明，miRNA通過靶向下游靶基因的翻譯參與介導各種疾病的發展[18]。組蛋白去甲基化酶2A（KDM2A）已被證實參與調控干細胞成骨分化[19]。據此推測，miR-122-5p可能通過靶向調控下游KDM2A進而參與調控BMSC成骨分化。首先，筆者利用雙熒光素酶報告試驗證實兩者之間存在相互結合關系；隨后，利用小干擾RNA證實沉默KDM2A能夠促進BMSC成骨分化；最后，通過功能回復實驗發現沉默KDM2A能夠促進BMSC成骨分化，而miR-122-5p inhibitor能夠逆轉si-KDM2A的促進作用。以上結果提示，miR-122-5p靶向KDM2A影響BMSC成骨分化。

值得說明的是，盡管本研究發現miR-122-5p能夠靶向KDM2A影響BMSC成骨分化，但對于KDM2A如何調控BMSC成骨分化的機制仍不清楚。KDM2A屬于組蛋白去甲基化酶的一種，后者已被發現參與調控組蛋白的甲基化，而甲基化能夠改變DNA的折疊和暴露狀態，進而影響干細胞的分化[10]。提示KDM2A可能通過參與調控組蛋白甲基化而影響BMSC成骨分化。除了miR-122-5p能夠靶向KDM2A影響BMSC成骨分化，關于miR-122-5p和KDM2A在骨質疏松中的診斷和治療價值仍有待進一步研究。以往研究表明，miRNA可以作為獨立診斷標志物，但由于本研究缺少人體組織樣本，miR-122-5p能否作為骨質疏松的診斷和預后標志物仍需進一步臨床研究。此外，由于KDM2A可能通過參與調控組蛋白甲基化進而影響BMSC成骨分化，提示KDM2A有望為骨質疏松的分子治療提供新的研究方向。需要注意的是，本研究使用的人源的BMSC，由于人和動物之間存在種屬差異，因此本研究僅從細胞水平探索了miR-122-5p和KDM2A在BMSC成骨分化中的作用，關于miR-122-5p和KDM2A在動物實驗中的效果以及在臨床中的使用價值仍有待進一步深入研究。

綜上所述，miR-122-5p靶向抑制KDM2A表達進而促進BMSC成骨分化。但BMSC成骨分化機制復雜，仍有待進一步研究。