花生蛋白糖基化修飾及其應用的研究進展

劉沛龍,劉昆侖

河南工業大學 糧食與物資儲備學院,河南 鄭州 450001

隨著全球人口數量的增長及消費水平的提升,人們對蛋白質需求日益增加,動物蛋白資源逐漸供不應求[1]。近年來,國內外研究人員不斷尋找優質蛋白資源以改善資源短缺的現狀。研究發現,植物蛋白價格低廉、可獲得性高、對環境的影響小,不僅能夠滿足人們對蛋白質的日常營養需求,還能減少環境污染[2]。隨著對植物蛋白研究的不斷深入,其在食品工業中得到了廣泛的應用,一些植物蛋白被用來代替肉類、雞蛋、牛奶等[3]。與其他植物蛋白相比,花生蛋白具有低水平的抗營養因子、良好的氨基酸結構以及較高的有效利用率,易于人體消化吸收[4]。在食品工業中,蛋白質的營養、感官、理化特性等都起著重要的作用[5]。由于花生蛋白主要由球蛋白和伴球蛋白組成,球蛋白在商業化生產中容易發生變形聚集,常以聚集體的形式出現,因此呈現較差的溶解性[6]。故花生粕作為良好的花生蛋白資源,多被用作動物飼料或農業廢棄物,并未得到充分利用[7]。因此,改善花生蛋白的功能特性,充分利用現有的花生蛋白資源是亟須解決的問題。

近年來,通過蛋白質改性來改善其功能特性得到了廣泛的關注。蛋白質改性可分為物理改性、化學改性以及酶改性[8],常見的改性方法包括球磨處理、超聲處理、凍融循環處理、糖基化修飾、磷酸化[9-12]等。其中,化學修飾雖具有較好的有效性,但大多數具有毒性,會對人體健康產生危害。糖基化修飾過程反應溫和,且不需要加入外來化學物質,修飾后花生蛋白的理化特性都有不同程度的改善。糖基化修飾是一種綠色、有效且具有潛力的改性方法,在食品工業中有良好的應用前景[13]。作者主要從糖基化修飾機理、常見的糖基化修飾方法、糖基化對花生蛋白功能特性及花生過敏原的影響、糖基化花生蛋白的應用等方面進行綜述。

1 糖基化修飾機理

美拉德反應廣泛存在于食品加工中,又被稱為非酶促褐變反應,屬于蛋白質的化學改性范疇。糖基化修飾是基于美拉德反應將碳水化合物以共價鍵形式與花生蛋白分子上的α-或ε-氨基相連接而形成糖基化蛋白的化學反應,反應方程如圖1所示。

圖1 糖基化反應方程Fig.1 Glycosylation reaction equation

美拉德反應最早由法國化學家Maillard于1912年提出,是一個復雜的化學反應體系,主要分為3個階段[14-17]。第1階段,蛋白質游離的氨基與還原糖中的羰基發生縮合反應,生成希夫堿,而后經Amadori重排生成更穩定的1-氨基-1-脫氧-2-酮糖。第2階段,Amadori重排產物發生降解,當pH≤7時,經1,2-烯醇化反應生成糠醛或羥甲基糠醛,當pH>7時,主要是2,3-烯醇化反應,降解為還原素和各種裂變產物類,如丙酮、雙乙酰等,這些高活性的降解產物進一步進行Strecker降解反應生成醛類、吡嗪類及褐色色素。第3階段,中期的降解產物進一步發生包括環化、脫水、烯醇化、氧化、碎片化、重排、異構化和縮合在內的一系列反應,生成具有有色化合物的高分子量聚合物,統稱為類黑素。

美拉德反應產物是多種感官活性化合物,影響蛋白質的質量,如結構、風味、顏色等[18]。經糖基化修飾后,蛋白質的功能特性都明顯改善。但研究表明,美拉德反應得到的糖基化中間體容易參與進一步的降解、交聯等反應,產生晚期糖基化終產物(AGEs)[19]。在糖基化修飾中,Nε-羧甲基賴氨酸和Nε-羧乙基賴氨酸被認為是兩種典型的AGEs[20]。這些美拉德反應最終階段產生的AGEs被認為是有毒有害物質[21]。一方面,AGEs可以誘導使蛋白質結構和功能改變;另一方面,AGEs可以激活受體介導的細胞反應,誘導促炎分子的合成,影響細胞存活、分化和增殖,并誘導代謝變化[22]。AGEs在正常的生理條件下,能夠被人體清除,在高血糖或氧化應激條件下,則會被廣泛積累[23]。為預防AGEs對人類健康帶來不利影響,近年來,美拉德反應中后期的反應機理成為研究者們聚焦的重點。由于美拉德反應機理復雜,對其生成AGEs的機理研究仍處于初步階段。目前常用酸水解后賴氨酸和糠氨酸的定量對早期美拉德反應的進展進行測定[24]。糖基化反應過程中,反應速率取決于溫度、pH值、糖的種類、水分活度等多種因素[25]。過高的反應溫度、過長的反應時間等都會增加類黑素等美拉德反應晚期產物形成,如何通過構建合理的反應體系將美拉德反應控制在偶合初期以限制或減少AGEs的生成是目前需要攻克的難點。

2 糖基化修飾方法

2.1 干熱法

蛋白質糖基化修飾的傳統方法可分為干熱法和濕熱法[26]。干熱法通過蛋白與多糖混合,制備成水分散體,再將分散體冷凍干燥后在干燥器中孵育1周左右,得到糖基化產物。常用溫度為50～60 ℃,相對濕度為60%～85%,降溫即可終止反應的進行[27]。研究表明,干熱法獲得的產物具有良好乳化性能,能夠在不需要化學物質的前提下進行蛋白質與多糖的共價偶聯[28]。通過干熱法得到的復合物具有較強的穩定性與分子完整性。易于控制反應條件,在一定條件下不產生有毒有害產物[29]。溫度是影響蛋白質糖基化的重要因素,溫度過高會增加美拉德反應產生AGEs的概率,不能保障糖基化蛋白的安全性。干熱法一般選用的溫度較溫和,但反應時間較長,反應難以精確控制,反應階段容易進一步向中后期進行。此外,反應過程中需要控制水分活度,耗能高,后期冷凍干燥作為工業化生產成本也較高,在食品的生產應用中存在缺陷。

2.2 濕熱法

濕熱法一般會選用在水或油溶液中加熱,不需要冷凍干燥,一定程度上簡化了反應過程,與干熱法相比,縮短了反應時間。Pirestani等[30]通過濕熱法將阿拉伯膠與菜籽油分離蛋白進行偶聯,糖基化后的綴合物能夠顯著降低蛋白質的熱聚集作用,改善蛋白質的溶解性、乳化性等功能特性。但濕熱法對反應過程的控制相對困難,且得到的接枝物比較復雜[31]。在高溫條件下,天然蛋白質易發生變性,無法有效獲得品質良好的糖基化產物。因為反應混合物中存在水,可能會促使反應向相反方向進行,從而降低產率[32]。通過輔助手段結合濕熱法處理,是目前具有良好前景的方法,能夠有效促進糖基化修飾,在短時間內進行接枝改性。

2.3 其他輔助方法

為彌補傳統糖基化修飾存在的缺陷,常以其他技術手段輔助進行糖基化反應,如超聲、冷等離子體、球磨預處理、酶解[33-36]等,以加速反應速度,適用于工業化生產。多數輔助手段通過改變蛋白質結構,促進蛋白展開,從而使糖基化位點暴露,增加糖基化效率。如超聲處理通過減小蛋白質的粒徑、減少α-螺旋等方式改變蛋白質構象,增加糖基化位點,促進蛋白質與糖的偶合。有研究表明,中功率超聲處理能夠將蛋白質分散成可溶性的小分子蛋白質聚集體,增加蛋白質溶解度[37]。靜電紡絲對蛋白質-多糖混合物進行物理結構的改變也能夠較好地解決一些生產缺陷。在靜電紡絲過程中彎曲與拉伸運動產生的分子排列,能夠使反應物保持緊密的分子接觸;在纖維的物理狀態下,糖基化修飾還能減少褐變,限制AGEs的生成[38]。但輔助手段需要考慮成本與可操作性,處理強度、反應溫度等都會影響偶聯物的功能性質,從而影響其在商業化生產中的應用。在追求效率的同時,還需要注意對接枝物品質的影響,盡量在美拉德反應第1階段進行蛋白質與糖的偶合,避免AGEs產物對人體造成危害。

3 糖基化對花生蛋白功能特性的影響

3.1 溶解性

溶解性是指物質在溶劑中溶解能力大小的一種屬性。溶液與固體相處于平衡狀態下的濃度,稱為溶解度[39]。除溫度、pH值等環境因素外,溶解度還受蛋白質分子本身的結構影響,如氨基酸組成、蛋白質分子構象等[40]。由于花生蛋白自身的剛性球形結構,溶解性較差,在食品加工中未能得到有效利用。糖基化修飾過程中,親水多糖能夠有效提高蛋白質與水分子的親和力,提高溶解性?；ㄉ鞍?多糖綴合物在等電點附近的溶解度高于天然蛋白質,表明多糖提供了空間穩定性[41]。Yu等[42]利用冷等離子體技術將花生蛋白與田菁膠(SG)進行共價結合,冷等離子體處理可以有效地誘導并加速美拉德反應的發生,增加—OH含量,從而改善花生蛋白的水化性能。Li等[43]通過干熱法將花生蛋白進行糖基化修飾并對其溶解度與結構進行了分析測定,結果表明,相較于天然花生蛋白,蛋白質與多糖綴合物的溶解度顯著提高。結構分析顯示,綴合物較低的表面疏水性是由于多糖的屏蔽作用。多糖含量對花生蛋白溶解度具有一定的影響,過量的多糖甚至對溶解度具有負作用,如Cai等[44]研究了多糖對花生蛋白理化性質的影響,結果顯示,隨著多糖濃度的增加,蛋白質的溶解度呈現先增加后減小的趨勢。推測為復合物形成了不溶性聚集體,連續的蛋白質大離子附著,多糖的總體凈電荷減少,導致在可溶絡合物中形成電中性,由于氫鍵的形成以及疏水、偶極子和電荷-偶極子相互作用而聚集沉淀。合適的多糖類型與濃度對糖基化反應至關重要,此外,溫度、pH值等外部因素也應成為關注的重點。溶解性的提高也有利于花生蛋白其他理化性能的改善,使其在食品加工中發揮更高的應用價值。

3.2 乳化性

乳化性是指油與水形成乳狀液的能力。蛋白質作為優質的乳化劑,同時含有疏水區和帶電的親水區,降低表面張力的同時在乳液界面上相互作用[45]。由于蛋白質在其等電點時容易發生聚集,使其在食品工業中的應用受到限制。經糖基化修飾后,蛋白質同時具有良好的乳化性與穩定性。糖基化產物形成的界面結合力比相應的非共價產物更強,有助于綴合物在油滴周圍聚集成一個堅固、黏彈性的多層膜,從而阻止了蛋白的絮凝和聚集[46]。其他技術輔助糖基化修飾能夠更有效地提高蛋白質的乳化性,如冷等離子體技術可以展開花生蛋白的二級、三級結構,暴露糖基化位點從而有效地誘導快速糖基化反應。Ji等[47]通過等離子體將花生分離蛋白與葡聚糖糖基化后進行了乳化液穩定性的測定,結果顯示,花生分離蛋白與葡聚糖綴合物的乳化液穩定性高于混合物,在蛋白質的溶解度達到最大值時,乳化液穩定性也達到最高,表明蛋白質的溶解性是影響乳化性的重要因素。楊偉強等[48]研究了超聲波輔助花生濃縮蛋白糖基化改性工藝,結果表明,改性濃縮蛋白的乳化活性和乳化穩定性高于濃縮蛋白。在一定糖濃度范圍內,花生蛋白的乳化活性會逐漸增大。當糖濃度過大時,過多的羰基競爭參與糖基化反應,反而會降低糖基化蛋白的生成量,乳化活性與乳化穩定性也逐漸降低。曲剛[49]在研究中發現,糖基化蛋白的乳化特性與還原糖類型、比例和反應溫度等密切相關,在相同的反應條件下,麥芽糖偶合得到的綴合物乳化性及乳化穩定性均優于葡萄糖。推測單糖的羰基含量更高,增加了氨基和羰基結合的概率,更有利于反應的進行。60 ℃時花生蛋白能夠保持良好的乳化活性,過高的溫度容易引起蛋白質變性從而降低乳化穩定性。目前研究更傾向于借用輔助手段,更高效地進行糖基化反應,但需要關注的是,改進糖基化本身的反應體系從而得到優質的糖基化產物也具有重要意義。經糖基化修飾的蛋白質作為乳化劑、生物壁材等應用于食品、藥品工業中都有廣闊的發展前景。

3.3 起泡性及泡沫穩定性

蛋白質傾向于在氣-液水界面積聚,構成一個界面層,從而改變表面性質。通常蛋白質能夠有效地穩定泡沫,并防止它們恢復到由平面界面分開的兩個體相,在許多食品中起到穩定食品系統的作用[50]。因此在食品加工過程中,起泡性是重要的性能之一。溶解性是決定蛋白質起泡性及泡沫穩定性的先決條件,溶解性的增強通常就伴隨著起泡性、泡沫穩定性的增強。此外,蛋白質的起泡性及泡沫穩定性還與pH值、溫度、鹽濃度等因素有關。糖基化修飾為蛋白提供了額外的親水性基團并一定程度改變了蛋白質的構象,增加了蛋白質的溶解度,加速了氣-液界面的吸附,從而提高了泡沫容量和穩定性[51]。Liu等[52]將花生蛋白與葡聚糖進行糖基化修飾,結果表明,糖基化花生蛋白起泡性與泡沫穩定性都顯著提高。經分析,葡聚糖作為一種非表面活性的親水多糖,在氣-水界面吸收的傾向不大,但可以作為增稠劑或膠凝劑,增強蛋白質泡沫的穩定性,從而經過綴合后改善花生蛋白的泡沫穩定性。糖基化蛋白具有更高的溶解度,比原始蛋白質更快地從本體轉移到界面,從而提高花生蛋白的起泡性。Han等[53]為改善花生分離蛋白的功能特性,采用超聲輔助濕熱法制備了花生分離蛋白與玉米絲多糖(CSP)的共價復合物,結果顯示,CSP的加入顯著提高了綴合物的起泡性和泡沫穩定性,且隨著多糖濃度的增加泡沫穩定性逐漸提高。當花生分離蛋白的溶解度較高時,容易在空氣和水之間形成一層膠膜,從而提高了蛋白質的泡沫穩定性。同時,CSP的絡合作用抑制了蛋白質的聚集,有利于提高溶液起泡性。多糖的分子量也是影響綴合物界面性質的重要因素。低分子量多糖與蛋白質形成的綴合物相較于高分子量具有更強的抵抗表面活性劑引起的空氣-水界面位移的能力,能夠提高更多的還原端末端進行糖基化修飾從而提高綴合物生成的效率[54]。研究不同分子量多糖及蛋白質與多糖比例的關系對后續提高糖基化反應效率具有重要意義。在食品體系中,蛋白質的起泡性能夠使其在食品界面中形成黏彈性薄膜,廣泛應用于烘焙及啤酒制作等。

4 糖基化對花生過敏原的影響

花生是較常見的重要食物過敏原之一,會導致嚴重的過敏反應?；ㄉ^敏原的種類大致可分為三類：Ara h1、Ara h2、Ara h3[55]。其中Ara h1是最重要的花生過敏原,在花生過敏原中含量最高,占總花生蛋白含量的12%～16%[56]。當花生過敏患者的抗血清同時被Ara h1分子處理時,這些血清中的免疫球蛋白E (IgE)抗體將與Ara h1分子反應,表明Ara h1的C端和N端結構域對花生糖過敏原的表位形成有重要作用[57]?；ㄉ鞍卓梢耘c糖共價或通過聚集結合,從而隱藏或破壞表位,糖蛋白的形成掩蓋了核心抗原表位并阻斷了抗原抗體反應從而降低了過敏反應[58]。Tian等[59]對糖基化花生蛋白進行表征,結果顯示,經葡聚糖糖基化的rAra h1具有IgE結合能力,交聯過程中保留了完整的線性表位,增強了花生蛋白的過敏反應。而在40 ℃時,rAra h1與葡萄糖胺之間的糖基化降低了過敏原抗原性,表明糖基化過程中形成的綴合物的結構受溫度、糖種類等影響,因而表現出不同的過敏性。40 ℃時葡聚糖糖基化過程中形成的聚集物增加了空間位阻,破壞了完整的表位,導致rAra h1的免疫原性降低。也有研究推測,美拉德反應增加Ara h1的免疫原性和過敏原性是由于其能夠改變Ara h1蛋白的結構,增加其對消化酶的抵抗力,并通過影響B細胞和T細胞的分化,導致TH2細胞因子和特異性抗體的釋放增加[60]。史云鳳[61]將純化的重組花生Ara h1蛋白與葡萄糖干熱處理,模擬糖基化反應并對得到的終末糖基化Ara h1蛋白進行致敏性評估,結果顯示,經過高溫糖基化修飾蛋白AGE-Ara h1顯示出更高的過敏性。RBL細胞實驗表明,AGE-Ara h1致敏的小鼠血清有更高的RBL脫顆粒能力。雖然糖基化使Ara h1與IgE的結合能力略有下降,但增加了使RBL細胞脫顆粒的能力,進而引發更嚴重的過敏反應。研究糖基化對rAra h1結構和免疫反應性的影響,闡明糖基化對致敏性影響的反應機理,從而得到降低Ara h1變應原性的有效反應條件是目前研究的重點。

5 糖基化花生蛋白的應用

5.1 在包裝材料中的應用

為減少包裝材料對環境造成的污染,學者們聚焦于對可生物降解包裝的研究。由于植物蛋白具有環境可持續性,因此是當下最有吸引力和潛力的材料。通過美拉德反應獲得的蛋白質-多糖綴合物具有顯著的乳化特性、良好的拉伸強度和水蒸氣阻隔性能。Li等[62]采用干熱法將花生分離蛋白與阿拉伯膠進行糖基化,結果表明,與花生分離蛋白薄膜相比,糖基化薄膜的抗拉強度提高,水蒸氣滲透性降低。隨著糖基化程度增加,膜的網絡結構呈現更加均一和無定形狀態,并且能夠減少蛋白質的浸出。Lin等[63]將花生蛋白經木糖修飾后,制備花生分離蛋白薄膜,結果顯示,木糖在花生蛋白膜中的應用不僅提高了膜的強度和伸長率,而且降低了膜的水溶性,顯著改善了花生蛋白生物降解膜的力學性能。Liu等[64]以木糖和花生分離蛋白為基質制備了薄膜,結果與上述相同,花生分離蛋白與木糖進行交聯改性后,增加了花生蛋白的巰基含量和表面疏水性,顯著提高了薄膜的力學性能和耐水性。在產物制備過程中,部分蛋白質分子展開,導致蛋白質內部的疏水基暴露,增加了木糖分子與花生分離蛋白之間的共價鍵。糖基化蛋白質作為具有兩親性的產物,形成的薄膜作為壁材包埋具有更穩定的效果。邱佳歡[65]以糖基化改性后的花生球蛋白/酪蛋白和羧甲基殼聚糖作為主要原料,將其應用于表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的保護和運輸中,結果顯示,復合改性下的糖基化蛋白結構顯著變化,晶體構型由復雜趨向于有序。復合改性后的糖基化蛋白對EGCG具有較高的包封效果,此外還能延緩EGCG氧化分解,有效解決在模擬腸胃液中EGCG的突釋現象。目前研究結果表明,花生蛋白經糖基化修飾能夠得到性能良好的食品保鮮薄膜,并且其營養與環境保護方面均有較大的優勢。多數蛋白作為壁材、包封材料能夠保護包埋物的功能性,促進人體對包埋物的消化吸收,在實際應用中具有良好的發展前景。

5.2 在肉制品中的應用

花生蛋白作為優質的植物蛋白資源,在肉制品加工中能夠保持組織結構穩定并提高其風味特性[66]。在食品加工過程中,花生分離蛋白的加入能夠提高凝膠的持水性、彈性,形成更緊密的凝膠結構[67]。奧文芳[12]使用低聚異麥芽糖超聲輔助接枝改性花生蛋白并將其應用于魚糜中,結果表明,加入花生蛋白、花生蛋白接枝物均能改善魚糜的得率、質構性質,且添加糖基化后的花生蛋白的魚糜凝膠強度大于花生蛋白。糖基化引入的低聚異麥芽糖的親水性羥基不僅可鎖住水分,自身還可形成網絡結構,同時還可以和肌原纖維蛋白交聯形成三維網絡,達到改善凝膠強度的目的。目前,糖基化修飾后的花生蛋白在肉制品中的應用研究較少,其風味特性、抗氧化性等在肉制品中的潛力還需要進一步研究探索。

6 展望

花生蛋白含有低劑量的抗營養因子、良好的氨基酸組成,是優質的植物蛋白資源。由于花生加工后蛋白質一定程度的變性以及蛋白質自身結構的限制,使其在食品工業上的應用受到了局限。蛋白質糖基化修飾通過蛋白質與親水多糖共價連接,增加了羥基含量,提高了蛋白質與水分子的親和力,并對花生蛋白的構象產生一定影響,從而有效改善了花生蛋白溶解性、乳化性、起泡性等性能。在一定條件下,糖基化反應還具有降低致敏性的潛力。在食品工業生產中,糖基化修飾后的花生蛋白多用作食品保鮮膜或壁材,不僅性能良好且環境可持續性高,還能作為肉制品添加劑滿足不同食品中的特定營養功能。但目前對于糖基化美拉德反應后期產物的研究還不明確,現有的糖基化方法也并不具有在工業中大規模生產的能力。明確糖基化反應機理,建立合理的反應體系,利用現有輔助花生蛋白的糖基化反應,在減少反應時間的同時有效地進行糖基化接枝,減少糖基化晚期產物的生成是目前研究的重點。在保證蛋白質的功能價值及安全性的前提下,使糖基化修飾在大規模食品工業化生產中得到更廣泛的應用。