3,4-二羥基苯乙酸對高脂膳食誘導小鼠糖脂代謝紊亂的調節作用

丁桂園,任順成,朱曉艾

河南工業大學 糧油食品學院,河南 鄭州 450001

糖脂代謝紊亂被認為是誘導肥胖、2型糖尿病和心血管等慢性疾病的主要因素。聯合國《2019世界糧食安全和營養狀況》報告顯示,全球每年因肥胖致死400多萬人[1]。據國際糖尿病聯合會統計,2021年全球糖尿病患者人數達到5.37億;2045年全球糖尿病患病人數預計將達到7.83億[2]。糖脂代謝紊亂嚴重危害人類健康,不僅造成經濟負擔,而且導致人們生活質量和壽命下降。目前治療糖脂代謝紊亂的方法主要有口服降糖藥或減肥藥、注射胰島素和減肥手術等,但都存在一系列嚴重的副反應,如頭暈、失眠及腹瀉等[3-4]。因此,尋找安全、有效的膳食活性成分以預防機體的糖脂代謝紊亂勢在必行。近年來,具有減肥和降糖生物活性的多酚類膳食化合物引起了人們的廣泛關注。

槲皮素(3,3’,4’,5,7-五羥基黃酮)是一種膳食多酚,廣泛存在于蔓越莓、櫻桃、洋蔥、石刁柏、萵苣等水果和蔬菜中[5]。槲皮素及其糖苷類化合物因良好的安全性和生物活性,已被歐美國家批準作為食品補充劑并廣泛應用于功能食品中[6],具有抗肥胖[7-8]、抗糖尿病[9-10]、預防心血管疾病[11]、抗病毒[12]、抗過敏[13]、抗抑郁[14]等作用,其中有小部分(5%～10%)被胃腸道吸收,大部分(90%以上)在結腸微生物的作用下,生成易被吸收且可在體內發揮生物活性的小分子代謝物,如3,4-二羥基苯乙酸、3,4-二羥基苯丙酸、3,4-二羥基苯甲酸等[15-17]。據目前研究報道,這些小分子代謝物中僅有3,4-二羥基苯乙酸具有較高的清除自由基活性、抗炎活性、調節胰島素功能和防止肝損傷的作用[18-24]。例如,3,4-二羥基苯乙酸顯著抑制了過氧化氫誘導的肝細胞毒性,增強了總谷胱甘肽s-轉移酶活性[18],發揮抗氧化作用;3,4-二羥基苯乙酸通過防止氧化應激、細胞凋亡和線粒體功能障礙保護Min6胰腺β細胞免受膽固醇誘導的胰島素分泌受損[19];3,4-二羥基苯乙酸可以減少2型糖尿病小鼠的氧化應激和炎癥反應,減輕高血糖和胰島素抵抗,有助于緩解2型糖尿病癥狀[20];3,4-二羥基苯乙酸能夠增強大鼠離體胰島中的葡萄糖刺激胰島素分泌[21];3,4-二羥基苯乙酸在高糖條件下通過改善大鼠NRK-52E細胞中的胰島素信號和葡萄糖穩態而具有抗糖尿病作用[22-23];此外,3,4-二羥基苯乙酸可減少乙酰氨基酚對小鼠肝臟的毒性和防止肝損傷[24]。因此,3,4-二羥基苯乙酸可能是槲皮素及其糖苷類化合物在機體內調控糖脂代謝紊亂的主要活性物質。

目前關于3,4-二羥基苯乙酸調節糖脂代謝作用的研究主要集中于體外實驗,而關于其在體內具有調節糖脂代謝紊亂的生物活性尚未進行充分研究。因此,作者采用高脂膳食誘導C57BL/6 糖脂代謝紊亂小鼠模型,探討3,4-二羥基苯乙酸對糖脂代謝紊亂的調節作用,對指導治療糖脂代謝紊亂提供新思路和新方法,為全面評估3,4-二羥基苯乙酸的營養價值和功能特性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級雄性C57BL/6小鼠(許可證號：ZZU-LAC2021101216)：北京維通利華實驗動物技術有限公司;正常對照飼料(D12450J,能量配比為10%脂肪、70%碳水化合物、20%蛋白質)和高脂飼料(D12492,能量配比為60%脂肪、20%碳水化合物、20%蛋白質)：常州鼠一鼠二生物科技有限公司。動物飼料配方如表1所示。

表1 飼料配方Table 1 Compositions of experimental diets g

3,4-二羥基苯乙酸：上海源葉生物科技有限公司;甘油三酯(TG)試劑盒、總膽固醇(TC)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

FA1004電子分析天平：上海上平儀器公司;血糖儀：江蘇魚躍醫療設備股份有限公司;酶標儀、CL10高速冷凍離心機：賽默飛世爾科技(中國)有限公司;冰箱：海爾集團。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗

45只SPF級雄性5周齡的C57BL/6小鼠,適應性喂養1周后,隨機分配為3組(每組15只),分別為：正常對照組(ND組,飼喂正常飼料)、高脂模型組(HFD組,飼喂高脂飼料)、3,4-二羥基苯乙酸組(DOPA組,飼喂高脂飼料+0.05% 3,4-二羥基苯乙酸)。動物飼養于河南省實驗動物中心SPF級動物實驗室,5只/籠,飼養溫度(22±2) ℃,相對濕度(55±10)%,每隔12 h光照/黑暗循環,自由飲食飲水,共喂養10周。每周記錄每組小鼠的攝食量、飲水量和體重。第10周末,每組C57BL/6小鼠禁食8 h后,摘眼球采血、頸椎脫臼致死。隨后測量小鼠體長,解剖小鼠并取出器官組織(心、肝、脾、肺、腎及腎周脂肪和附睪脂肪),生理鹽水漂洗,濾紙吸干,稱量,立即放入干冰中冷凍,保存于-80 ℃的冰箱中。本次動物實驗經河南省實驗動物中心倫理委員會批準后,嚴格按照動物實驗要求開展。

1.3.2 小鼠體重和Lee′s指數的測定

實驗期間記錄小鼠精神活動、毛色變化、排泄物等生活狀況[25]。每周對各組小鼠稱重,記錄體重。小鼠處死后,記錄小鼠鼻尖至肛門的長度為小鼠的體長。根據各組小鼠體長和體重,計算各組小鼠的Lee′s指數(肥胖指數)。

Lee′s指數=小鼠體重1/3×103/小鼠體長。

1.3.3 小鼠臟器指數的測定

根據各組小鼠的臟器質量(心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟)與體重,計算各組小鼠的臟器指數。

臟器指數=臟器質量/體重×100%。

1.3.4 小鼠附睪脂肪和腎周脂肪系數的測定

根據各組小鼠的脂肪組織質量(附睪脂肪和腎周脂肪)與體重,計算各組小鼠的脂肪系數。

脂肪系數=附睪脂肪或腎周脂肪質量/體重×100%。

1.3.5 小鼠血清生化參數的測定

第10周實驗結束時采集小鼠的眼眶血,4 ℃、3 500 r/min離心15 min,然后保存于-80 ℃冰箱中。血清TG、TC、LDL-C和HDL-C水平按照市售試劑盒的說明書進行測定。

1.3.6 小鼠血糖的測定

第10周進行口服葡萄糖耐量實驗(OGTT)：禁食12 h后,所有小鼠接受2 h的OGTT檢測。按照葡萄糖劑量為2 g/kg,對小鼠進行灌胃,分別在6個不同的時間點：灌胃前(0 min)和灌胃后15、30、60、90、120 min,使用血糖儀測定血糖濃度,分別記為G0、G15、G30、G60、G90、G120。計算OGTT曲線的線下面積(AUC)。

1.4 數據統計與分析

所有數據均以平均值±標準差表示。采用SPSS 27.0進行單因素方差分析,比較組間的統計學意義。采用Origin 2021繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 小鼠一般生長情況

整個實驗過程中,動物房環境控制良好,干凈整潔,溫度、濕度均處于正常范圍。各組小鼠生活和精神狀況良好,正常進食進水,活動自如,對外界刺激反應迅速,無腹瀉。各組小鼠糞便的顏色為黑褐色,形狀為長顆粒狀,尿液正常。ND組和DOPA組小鼠體毛光澤度好。HFD組小鼠出現體毛油膩狀,DOPA組小鼠明顯改善。除ND組1只小鼠死亡外,其余組小鼠無死亡現象。

2.2 3,4-二羥基苯乙酸對高脂膳食小鼠體重、Lee′s指數、攝食量和飲水量的影響

體重是衡量動物健康和糖脂代謝平衡的直接指標。Lee′s指數作為肥胖指標,其值越大代表肥胖度越大[26]。由圖1(a)可知,第1周各組間小鼠體重均無顯著性差異。從第2周到第10周,HFD組小鼠的體重較ND組明顯升高。第5周時HFD組小鼠的體重超過ND組小鼠20%,即高脂模型小鼠建模成功。與HFD組相比,第1周至第3周,DOPA組小鼠的體重無顯著性差異;而從第5周至第10周,3,4-二羥基苯乙酸處理顯著降低了高脂膳食誘導小鼠的體重升高。從圖1(b)和(c)可知,與ND組相比,HFD組小鼠體重增加和Lee′s指數顯著增加,ND組和HFD組小鼠的體重分別增加(3.19±0.62 ) g、(9.50±1.16 ) g;Lee′s指數分別為337.70±7.81、363.89±8.43。飼養10周結束時,與HFD組相比,DOPA組小鼠體重增加(7.54±1.22 ) g、Lee′s指數(357.29±7.19)明顯下降。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2—圖4同。圖1 3,4-二羥基苯乙酸對高脂膳食小鼠體重、體重增加、Lee′s指數、攝食量和飲水量的影響Fig.1 Effects of 3,4-dihydroxyphenylacetic acid on body mass,body weight gain,Lee′s index,food intake,and water intake in high-fat diet mice

攝食量和飲水量也是反映小鼠健康狀況的重要指標。由圖1(d)和(e)可知,ND組、HFD組和DOPA組每只小鼠日均攝食量分別為(2.43±0.14) g、(2.46±0.10) g、(2.43±0.14) g;每只小鼠日均飲水量分別為(3.11±0.25) g、(3.08±0.21) g、(2.93±0.26) g ,但3組小鼠的每只小鼠日均攝食量和日均飲水量均無明顯差異。3,4-二羥基苯乙酸能夠在不影響攝食量和飲水量的前提下顯著降低高脂膳食小鼠體重的增加,減輕了其肥胖特征。

2.3 3,4-二羥基苯乙酸對高脂膳食小鼠臟器指數、附睪脂肪和腎周脂肪系數的影響

臟器指數是藥物毒性最敏感的指標之一。由圖2(a)可知,3,4-二羥基苯乙酸干預后,高脂膳食小鼠的心臟指數、脾臟指數、肺臟指數和腎臟指數與正常飼料飼養的小鼠相比沒有顯著差異,說明3,4-二羥基苯乙酸對小鼠的心臟、脾臟、肺和腎臟無毒害作用。高脂膳食對小鼠肝臟的損傷程度可用肝臟指數反映[27]。HFD組小鼠的肝臟指數(3.45%±0.09%)顯著高于ND組(3.25%±0.25%),說明高脂膳食誘導小鼠肝臟腫大和損傷;與HFD組相比,DOPA組小鼠的肝臟指數(3.30%±0.25%)顯著降低,說明3,4-二羥基苯乙酸能夠防止肝臟腫大、改善肝臟損傷和保護肝臟組織。

圖2 3,4-二羥基苯乙酸對高脂膳食小鼠臟器指數、附睪脂肪和腎周脂肪系數的影響Fig.2 Effects of 3,4-dihydroxyphenylacetic acid on viscera indexes,perirenal fat and epididymal fat coefficients in high-fat diet mice

脂肪系數可有效判斷機體糖脂代謝紊亂水平。由圖2(b)可知,與ND組相比,HFD組小鼠的附睪脂肪和腎周脂肪系數顯著升高,說明高脂膳食導致小鼠附睪和腎周脂肪的積累。與HFD組相比,DOPA組小鼠的附睪和腎周脂肪系數分別顯著降低了55.90%、40.50%,與Ting等[7]的研究結果相符,連續8周185 mg/kg的槲皮素膳食補充顯著降低高脂膳食誘導肥胖小鼠的附睪脂肪和腎周脂肪系數。以上結果表明,3,4-二羥基乙酸有效抑制了脂肪在體內的積累,因而控制了體重的增長。

2.4 3,4-二羥基苯乙酸對高脂膳食小鼠血脂的影響

血脂反映脂代謝的情況,主要與體內脂肪含量和機體對脂肪的利用有關,高脂膳食通常會導致血脂升高和異常[28]。血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C水平升高是高脂膳食小鼠的主要特征,提示小鼠患有高脂血癥[29]。由圖3可知,HFD組小鼠血清TC、TG和LDL-C水平分別比ND組顯著高了38.30%、16.28%、387.32%,說明高脂膳食可誘導 C57BL/6小鼠血脂代謝紊亂。與HFD組相比,DOPA組小鼠血清TC、TG和LDL-C水平分別顯著下降了20.90%、24.75%、45.09%。ND組、HFD組和DOPA組小鼠的HDL-C水平之間均沒有顯著差異。并且DOPA組的血清TC和TG含量基本達到ND組水平,說明3,4-二羥基苯乙酸顯著減少高脂膳食小鼠血脂水平。該結果與Kuipers等[8]的結論相符,0.1%的槲皮素在不影響高脂膳食C57BL/6小鼠食物攝入量的情況下顯著降低血清TG。Han等[30]研究結果表明,連續17周的0.04%五甲氧基槲皮素可顯著降低高脂膳食C57BL/6小鼠的血清TG水平,但其血清TG濃度高于本研究中0.05% 3,4-二羥基苯乙酸高脂膳食C57BL/6小鼠的血清TG濃度。因此,3,4-二羥基苯乙酸有利于減少脂質在肥胖小鼠血液中的積累,緩解高脂膳食誘導的脂代謝紊亂。

圖3 3,4-二羥基苯乙酸對高脂膳食小鼠血清TG、TC、LDL-C和HDL-C的影響Fig.3 Effects of 3,4-dihydroxyphenylacetic acid on serum TG ,TC ,LDL-C,and HDL-C in high-fat diet mice

2.5 3,4-二羥基苯乙酸對高脂膳食小鼠血糖的影響

葡萄糖耐量主要反映人體或動物自身對血糖濃度的調節能力[26]。AUC是反映葡萄糖被機體利用程度的一個重要參數,即AUC可評價葡萄糖的凈利用率。在第10周對小鼠進行口服葡萄糖耐量實驗,評估3,4-二羥基苯乙酸對高脂膳食小鼠糖耐量的影響。如圖4(a)所示,各組小鼠在被灌喂2 g/kg葡萄糖溶液后血糖濃度急劇增加,15 min時ND組和DOPA組小鼠的血糖濃度達到最大值,而30 min時HFD組小鼠的血糖濃度達到最大值,隨著時間增加,各組小鼠血糖濃度逐漸降低。其中0～120 min HFD組小鼠血糖濃度均顯著高于ND組,同時HFD組的AUC顯著升高(圖4(b)),說明高脂膳食誘導小鼠機體對血糖濃度調節能力下降,糖代謝紊亂。與HFD組相比,DOPA組小鼠在30 min的血糖濃度顯著降低(圖4(a)),同時3,4-二羥基苯乙酸可顯著降低高脂膳食小鼠的AUC(圖4(b))。由圖4(a)可知,DOPA組小鼠空腹血糖值顯著低于HFD組,并且120 min時DOPA組小鼠血糖值接近ND組。該結論與Peng等[9]的研究相一致,在生長期為12周時,0.1%槲皮素改善了高脂膳食誘導肥胖小鼠的糖耐量和胰島素抵抗的能力,減輕了脂肪的積累。但與Tan等[31]的研究結果相比,本研究中空腹血糖值和OGTT 120 min血糖值均低于干預12周0.05%蘆丁的高脂膳食C57BL/6小鼠。以上結果表明,3,4-二羥基苯乙酸具有顯著改善高脂膳食小鼠的糖耐量和調節血糖平衡的能力。

圖4 3,4-二羥基苯乙酸對高脂膳食小鼠OGTT和AUC的影響Fig.4 Effects of 3,4-dihydroxyphenylacetic acid on OGTT and AUC in high-fat diet mice

3 結論

通過測定各組小鼠的體重、體內脂肪系數、臟器指數、血脂血糖水平等基礎生理生化指標,分析3,4-二羥基苯乙酸對高脂膳食誘導肥胖小鼠糖脂代謝紊亂的調節作用。結果表明,3,4-二羥基苯乙酸可顯著減緩高脂膳食小鼠的體重增加和Lee′s指數,減少高脂膳食小鼠腎周脂肪和附睪脂肪的積累,降低高脂膳食小鼠的肝臟指數和血清中TC、TG和LDL-C的水平,改善高脂膳食小鼠血糖水平。3,4-二羥基苯乙酸具有調節高脂膳食誘導小鼠糖脂代謝紊亂的生物活性,但調節機制還需要進一步的實驗和臨床研究來探索,并尋找其潛在的臨床應用。