楓香葉片變色期全長轉錄組測序及分析

劉雄盛 尹國平 肖玉菲 蔣燚 王仁杰 黃榮林 姜英 王勇

摘?要：楓香因其樹形優美，入秋后葉色紅艷或橙黃，極具觀賞價值，是優良的景觀生態樹種。為了解楓香葉片變色及其次級代謝過程的遺傳基礎，該文以楓香5個葉片變色期葉片混合樣品為材料，利用單分子實時測序技術（PacBio平臺）對其進行全長轉錄組測序。結果表明：（1）全長轉錄組測序共獲得41.04 Gb的高質量數據，從中鑒定出全長非嵌合序列563 180條，通過聚類和去冗余，獲得27 269條高質量全長轉錄本。在27 269條全長轉錄本中預測到2 035條長鏈非編碼RNA（lncRNA），并檢測出14 892個簡單重復序列（SSR）位點和1 856個轉錄因子。（2）基因注釋結果表明，NR、GO、COG、KEGG 等8個數據庫共注釋了24 857條轉錄本，KEGG數據庫共獲得了124個條代謝途徑，主要有核糖體、碳代謝、氨基酸生物合成等，在類黃酮和葉綠素代謝途徑中分別有49和71個轉錄本參與。上述結果初步揭示了楓香葉片變色期轉錄組信息以及功能特性，為后續研究楓香葉片變色分子機制、色素代謝合成途徑和調控、相關功能基因克隆以及葉色改良提供基礎數據。

關鍵詞： 楓香， 葉片變色期， 單分子實時測序技術， 全長轉錄組， 基因功能注釋

中圖分類號：Q781

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2023）09-1710-11

收稿日期：2022-06-04

基金項目：廣西優良用材林資源培育重點實驗室自主課題（2019-A-03-02）；廣西林業科技推廣示范項目（桂林科研 ［2021］26號）。

第一作者： 劉雄盛（1988-），碩士，副研究員，主要從事林木遺傳育種研究，（E-mail）517261654@qq.com。

*通信作者：王勇，碩士，高級工程師，主要從事森林生態研究，（E-mail）12084474@qq.com。

Sequencing and analysis of full-length transcriptome from

Liquidambar formosana leaves in discoloration stage

LIU Xiongsheng， YIN Guoping， XIAO Yufei， JIANG Yi， WANG Renjie，

HUANG Ronglin， JIANG Ying， WANG Yong*

（ Guangxi Key Laboratory of Superior Trees Resource Cultivation， Guangxi Zhuang

Autonomous Region Forestry Research Institute， Nanning 530002， China ）

Abstract：Liquidambar formosana is an excellent landscape ecological tree species because its beautiful tree shape and red or orange leaves in autumn. In order to understand the genetic basis of discoloration and secondary metabolism of L. formosana leaves， the mixed samples of L. formosana leaves in five leaf discoloration stages were used for full-length transcriptome sequencing using single-molecule real-time sequencing technology （PacBio platform）. The results were as follows： （1） High-quality 41.04 Gb data were obtained by full-length transcriptome sequencing， from which 563 180 full-length non-chimeric sequences were identified， and 27 269 high-quality full-length transcripts were obtained by clustering and de-redundancy. In 27 269 full-length transcripts， 2 035 long-chain non-coding RNA （lncRNA） were predicted， and 14 892 simple sequence repeat （SSR） sites and 1 856 transcription factors were detected. （2） The results of gene annotation showed that a total of 24 857 transcripts were annotated in eight databases such as NR， GO， COG and KEGG， etc.， 124 metabolic pathways were obtained in KEGG database， including ribosome， carbon metabolism， amino acid biosynthesis and so on， and 49 and 71 transcripts were involved in flavonoid and chlorophyll metabolism respectively. The above results preliminarily reveal the transcriptome information and functional characteristics of L. formosana leaves during the leaf discoloration stage， and provide basic data for the follow-up study of the molecular mechanism of leaf discoloration， the pathway and regulation of pigment metabolism and synthesis， the cloning of related functional genes and the improvement of leaf color.

Key words： Liquidambar formosana， leaf discoloration stage， single-molecule real-time sequencing technology， full-length transcriptome， gene function annotation

隨著人們對觀賞植物需求的日益增加，彩葉樹種因其色相豐富、色澤艷麗、觀賞價值高等特點備受關注（王振興等，2016）。彩葉樹種葉色變化機制及其影響因素也隨之成了研究的熱點（李衛星等，2017）。近年來，學者們對彩葉樹種葉色變化做了大量研究，研究內容逐漸從葉片變色過程中表型形態和細胞結構變化（杜文文等，2019；梁玲等，2020）、生態適應意義（Menzies et al.， 2016；陳穎卓和黃至歡，2016）和生理生化特征（Junker & Ensminger， 2016；馮露等，2017；趙東輝等，2019）到葉色變化分子調控機制（陸小雨等，2020；Gao et al.， 2021）。葉片內葉綠素、花青素、類胡蘿卜素等色素含量變化是彩葉植物葉色變化的直接原因（Jiang et al.， 2016；李衛星等，2017）。目前，葉色變化分子機制研究主要集中在葉綠素、類胡蘿卜素和花青素等色素合成與調控有關基因、轉錄因子、miRNA（MicroRNA）及其靶基因的表達模式和功能等方面（Guan et al.， 2014；Yang et al.， 2015；Li et al.， 2015；Gao et al.， 2020），為植物葉色形成的遺傳和基因組研究、葉色調控以及彩葉植物資源開發奠定了基礎。

楓香（Liquidambar formosana）隸屬金縷梅科（Hamamelidaceae）楓香樹屬（Liquidambar），為落葉喬木，主要分布于中國秦嶺和淮河以南各?。▍^）海拔1 000 m以下的低山次生林內，在越南北部、老撾和朝鮮南部亦有分布（黃寧等，2021）。楓香適應性強，天然易更新，適宜紅、黃壤土，有荒山先鋒樹種之稱（羅紫東等，2016）。入秋后，楓香葉片逐漸變為紅色或橙黃，極具觀賞價值（王冬雪等，2017），然而，在不同區域楓香葉色表現差異較大，具明顯區域性，推測楓香葉色可能具有特異的調控機制。目前，對于楓香葉色變化的研究主要集中在葉色變化過程中的光合作用（羅紫東等，2016）、色素含量（劉儒等，2017；王冬雪等，2019）等生理生化方面。在分子生物學方面，Wen等（2014）利用二代測序技術對楓香秋葉衰老時基因表達譜進行了研究，并對秋季變色和葉片衰老過程中可能的基因調控進行了討論。然而，由于二代測序技術讀取序列短，拼接時無法提供長轉錄本，且會丟失可變剪接等重要信息。因此，目前，對于楓香葉片變色分子機制的研究仍然缺乏遺傳信息，限制了楓香葉色資源的開發利用。

PacBio單分子實時（single-molecule real-time， SMRT）測序技術測序讀長遠超Illumina等二代測序技術，因此可以對完整的mRNA直接進行從頭測序，從而得到轉錄本的全長信息，具有發現更多可變剪切序列和新功能基因，改善基因組注釋，鑒定更多的長鏈非編碼RNA（long-chain non-coding RNA， lncRNA）以及準確定位融合基因等特點（Tian et al.， 2018；夏麗飛等，2020），廣泛應用于轉錄組學、表觀遺傳學和大型基因組組裝等領域（趙陸滟等，2019；吳志銘等，2020）。夏麗飛等（2020）利用PacBio單分子實時測序技術獲得紫鵑茶樹（Camellia sinensis var.asssamica）全長轉錄本信息，為其變色機制研究提供基礎數據。Jia等（2020）對高山杜鵑（Rhododendron lapponicum）進行全長轉錄組測序，獲得75 002個高質量全長轉錄本，為其花色形成機制研究提供參考。本研究通過PacBio的單分子實時測序技術進行楓香葉片變色期全長轉錄組測序，獲取高質量全長轉錄本進行分析和功能注釋，旨在為后續研究楓香葉片變色分子機制、色素代謝合成途徑和調控、相關功能基因的克隆以及葉色改良提供遺傳基礎。

1?材料與方法

1.1 實驗材料

楓香葉片變色期材料采自廣西壯族自治區百色市德?？h紅葉森林公園（23°21′19″ E、106°39′5″ N），采用平均木法，選取5株生長健壯的楓香植株。在每株楓香樹上選取東、南、西、北4個方向的枝條做好標記，自2018年9月底開始，每15～20 d采集樣品1次，每次采樣時在每株楓香的每個枝條上采集5片完整葉片進行混合，共采集了5次樣品。各時期葉片顏色如圖1所示。

1.2 RNA提取和cDNA文庫構建

采用Trizol試劑提取楓香各時期葉片樣品的總RNA（ribonucleic acid），用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA降解和污染情況。使用NanoDrop 2000分光光度計測量RNA的純度、濃度和吸收峰。進一步用Aligent Bioanalyzer 2100檢測RNA質量。RNA檢測合格后，取各時期28S/18S＞1，且RIN＞6.5的RNA 等量混合，使用SMARTerTM PCR cDNA Synthesis Kit合成mRNA（messenger RNA）的全長cDNA（complementary DNA），通過PCR（polymerase chain reaction）擴增放大全長cDNA進行末端修復，并連接SMRT啞鈴型接頭進行核酸外切酶消化，獲得一個1～6 kb的文庫。在Pacific Bioscience RS II平臺上進行SMRT測序（委托百邁客生物科技有限公司）。

1.3 測序數據的質量控制和序列聚類

將原始序列中長度小于50 bp的片段和準確性小于0.90的序列過濾，獲取到過濾后的測序數據。根據序列中的接頭，將序列轉換成環形一致序列CCS（circular con-sensus），再根據CCS判斷是否有3′引物、5′引物以及PolyA，將序列分成全長和非全長序列。將來自同一轉錄本的全長序列聚類，相似的聚成一簇，每個簇得到一條一致序列，校正后，獲得用于后續分析的高質量序列（丁玉梅等，2020）。

1.4 轉錄組完整性評估和結構分析

使用CD-HIT（Cluster Database at High Identity with Tolerance）軟件去除轉錄本中的冗余序列，獲得非冗余轉錄本序列；利用BUSCO（Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs）對去冗余后的轉錄本進行完整性評估；使用TransDecoder軟件進行轉錄本編碼區序列及對應氨基酸序列預測；利用CPC（Coding Potential Calculator）分析、CNCI（Coding-Non-Coding Index）分析、Pfam（Protein Families）蛋白結構域分析、CPAT（Coding Potential Assessment Tool）分析4種方法預測lncRNA；篩選500 bp以上的轉錄本，利用MISA（MIcroSAtellite identification tool）軟件做SSR（simple sequence repeat）分析。

1.5 轉錄本功能注釋

使用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）軟件將得到的非冗余轉錄本序列與NR（Non-Redundant Protein Sequence Database）、Swiss-Prot（Swiss-Prot Protein Sequence Database）、GO（Gene Ontology）、COG（Clusters of Orthologous Groups of Proteins）、KOG（Clusters of Orthologous Groups for Eukaryotic Complete Genomes）、eggNOG（Evolutionary Genealogy of Genes： Non-supervised Orthologous Groups Database）、Pfam、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數據庫進行比對，獲得轉錄本的注釋信息（鄒智等，2021）；利用iTAK（Plant Transcription Factor & Protein Kinase Identifier and Classifier）軟件鑒定轉錄因子。

2?結果與分析

2.1 楓香葉片變色期全長轉錄組文庫構建

使用2個SMRT cell進行全長轉錄組測序，獲得41.04 Gb清潔數據。從中提取到731 849條CCS，約計1 178 416 098 bp。CCS平均長度為1 610 bp（圖2：A），測序平均深度為46×（圖2：B）。從731 849條CCS中鑒定出全長非嵌合序列FLNC（full length reads non-chimeric）563 180條，占比為76.95%，其長度分布如圖2：C所示。對FLNC進行聚類，獲得50 736條一致序列，校正后，共得到50 282條（99.11%）高質量一致序列，長度分布如圖2：D所示。對獲得的高質量一致序列去冗余，得到27 269條全長轉錄本。

2.2 編碼區序列、lncRNA和SSR分析

通過編碼區序列及對應氨基酸序列的預測，共獲得25 408個開放閱讀框ORF（open reading frame），其中，20 281條ORF是完整的，占比79.57%。lncRNA預測分析中，CPC、CNCI、CPAT和Pfam分別預測到3 028、2 848、5 132和6 406條lncRNA，2 035條為共有序列（圖3：A）。利用MISA軟件篩選500 bp以上的轉錄本，共獲得14 892個SSR位點，其中單堿基SSR有5 124個，數目最多，其平均密度約為每Mb 43.5個（圖3：B）。

2.3 轉錄本功能注釋

8個數據庫的功能注釋結果顯示（表1），共注釋24 857條序列，占總轉錄本的91.15%。在NR注釋的物種中，葡萄（Vitis vinifera）占比最高，為36.39%，其次是可可樹（Theobroma cacao，7.09%）、蓮（Nelumbo nucifera，6.71%）、麻楓樹（Jatropha curcas，3.41%）等（圖4）。

GO注釋的17 535個轉錄本中，包含生物過程（49 314）、細胞組分（36 008）、分子功能（21 366）3大類51個亞類。其中，生物過程中代謝過程和細胞過程占比較高，分別為69.4%和59.1%；細胞組分中細胞區域和細胞占比較高，分別為47.1%和46.8%；分子功能中催化活性和結合功能占比較高，分別為53.3%和47.8%（圖5）。

COG注釋中， 一般功能預測（20.11%）所占比例最高，其次為轉錄（9.34%）、轉錄信號轉導機制（8.81%）以及復制、重組和生物發生（8.29%）等（圖6）。

KEGG數據庫中共注釋10 666個轉錄本，根據代謝途徑分為機體系統（289）、代謝（6 596）、遺傳信息處理（2 920）、環境信息處理（304）、細胞過程（542）5個一級代謝通路和18個二級代謝通路以及124個三級代謝通路（圖7）。其中，碳水化合物代謝（1 919）、翻譯（1 735）、全局和概述圖（1 318）、氨基酸代謝（1 167）以及折疊、分類、降解（1 044）等二級代謝通路注釋的轉錄本較多。三級代謝通路中核糖體（693）、碳代謝（617）、氨基酸的生物合成（473）、內質網中的蛋白質加工（437）、剪接體（348）、糖酵解/糖異生（296）、氧化磷酸化（292）、RNA運轉（269）、光合生物體中的碳固定（239）、植物激素信號轉導（235）等注釋的轉錄本較多。

2.4 轉錄因子

使用iTAK軟件共預測得到轉錄因子1 856個，分屬159個基因家族。其中，RLK-Pelle_LRK10L-2家族轉錄因子最多，為97個，其次為RLK-Pelle_DLSV，為66個。圖8顯示了轉錄因子數排名前20的基因家族。

3?討論與結論

近年來，SMRT測序已成為全長轉錄組研究的最可靠、有效的策略， 特別是對于沒有參考基因組序列的非模式植物（潘敏等，2020；鄒智等，2021）。本研究應用SMRT測序技術，在PacBio RS II平臺上對楓香葉片變色期進行了研究，總共產生了41.04 Gb的測序數據，從中共提取到731 849條全長序列，全長非嵌合序列占76.95%，測序質量較好，能夠滿足后續挖掘基因信息的需要。SMRT測序技術獲得的轉錄本的長度比下一代高通量測序技術獲得的轉錄本的長度要長（Jia et al.， 2020）。本研究中，楓香葉片變色期轉錄本的平均長度為1 610 bp，遠高于Wen等（2014）利用Illumina測序技術得到的楓香綠葉和紅葉轉錄本長度（165 bp），這說明PacBio SMRT測序技術是獲取轉錄本序列，特別是獲取長轉錄本序列的有效方法。

lncRNA是一類轉錄本長度大于200 nt的RNA分子，參與調節植物的發育和生長、次生代謝和植物的逆境反應（Liu et al.， 2019）。本研究中，我們用4種方法在楓香變色期全長轉錄組中獲得2 035條lncRNAs，這些lncRNAs將為進一步研究楓香葉色變化分子機制奠定基礎。SMRT測序獲得的轉錄本開發SSR標記是一種有效可行的方法（夏麗飛等，2020）。本研究分析楓香葉片變色期全長轉錄組，共檢測到14 892個SSR位點，單堿基SSR數量最多。楓香分布范圍廣，抗逆性強，葉片呈色特異。因此，上述SSR位點為楓香遺傳多樣性研究、比較基因組學研究、基因作圖研究、種群遺傳學研究和其他類型的遺傳研究提供有價值的遺傳工具（李文燕等，2020；Wu et al.， 2020）。

在8個數據庫中，有24 857個楓香葉片變色期轉錄本通過序列比對進行了注釋，注釋轉錄本比例為91.15%，遠高于Wend等（2014）利用二代測序技術注釋的轉錄本比例（56%）。這表明本研究鑒定到大量楓香葉片中的基因。剩下的2 412個轉錄本沒有BLAST匹配，可能代表了楓香葉片特異的基因或未知基因。NR注釋結果表明，楓香葉片全長轉錄組序列信息與葡萄最相似（36.39%），與Wend等（2014）的研究結果一致。GO、COG和KEGG分類結果表明，大量轉錄本參與轉錄、復制、重組和修復，并具有催化活性，具有不同的分子功能，有10 666份轉錄本被分配到特定的途徑，參與多種生物學途徑。因此，我們的研究結果為進一步開展楓香葉色變化的分子研究提供了豐富的遺傳信息。

植物葉片內葉綠素、花青素以及類胡蘿卜素含量比例和分布決定了葉片的顏色，而色素代謝主要受結構基因和轉錄因子調控（Becker et al.， 2014；李衛星等，2017；陳璇等，2020）。相關研究表明，葉綠素含量降低，花色素苷大量積累是導致楓香葉片變紅的直接原因（劉儒等，2017；Yin at al.， 2022）。前人研究表明，HEMA1（glutamyl-tRNA reductase 1）、CAO（chlorophyllide a oxygenase）等基因是調控葉綠素合成的重要基因（Wu et al.， 2007），NYC1（nonyellow coloring 1）和NOL（non yellow coloring1-like）基因在葉綠素降解過程中起關鍵作用（Sato et al.， 2007），HD-Zip、WRKY 和GATA家族的轉錄因子可調控葉綠素含量（An et al.， 2014; 李衛星等，2017）。在本研究的葉綠素代謝途徑中，有27個轉錄本被注釋為HEMA（glutamyl-tRNA reductase）、PPOX（protoporphyrinogen oxidase）、CHLD（magnesium chelatase subunit D）、CHLM（magnesium chelatase subunit M）、POR（light-dependent protochlorophyllide reductase）、CAO、NYC1、NOL、HCAR ［7-Hydroxymethylchlorophylla （hmchl） reductase］基因，有17、55、19個轉錄本分別屬于HD-Zip、WRKY 和GATA家族。尤其是在葉綠素降解過程中起關鍵作用的NYC1和NOL基因，可能是調控楓香葉片葉綠素含量的關鍵基因。

C4H（cinnamate 4-hydroxylase）、CHS（chalcone synthase）、F3H（flavanone 3-hydroxylase）、F3′H（flavonoid 3′-hydroxylase）、F3′5′H（flavonoid-3′，5′-hydroxylase）、DFR（dihydroflavonol-4-reductase）和ANS（anthocyanidin synthase）是調控植物花青素生物合成的關鍵酶，直接影響花青素合成（許倩等， 2020；Jia et al.， 2020），MYB和bHLH家族的轉錄因子通過調節花青素生物合成中基因的表達起著關鍵作用（劉愷媛等，2021）。本研究中，有49個轉錄本參與類黃酮生物合成途徑，在花青素合成途徑中，有31個轉錄本被注釋為編碼C4H、HCT（shikimic acid/quinic acid hydroxy cinnamyl transferase）、CYP98A（cytochrome P450）、C3′H（p-coumaroyl shikimate/quinate 3′-hydroxylas）、CHS、F3H、CYP75B1（cytochrome P450 75B1）、DFR、ANS的關鍵基因，有36和46個轉錄本分別屬于MYB和bHLH家族。這些參與葉綠素代謝和花青素生物合成的基因將有助于后續進一步理解楓香的葉色調控機制。

綜上所述，本研究楓香葉片變色期全長轉錄組測序共獲得41.04 Gb的高質量數據，獲得27 269條高質量全長轉錄本，并注釋了24 857條轉錄本，還預測到2 035條lncRNA，檢測出14 892個SSR位點和1 856個轉錄因子。初步揭示楓香葉片變色期轉錄組信息以及功能特性，為后續開展楓香葉色變化分子調控機制以及葉色改良研究提供基礎數據。

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（責任編輯?周翠鳴）