類風濕關節炎患者血清外泌體長鏈非編碼RNA Hotair和XIST的表達及意義*

于娟,孫寧,宋淑圣,張力,張健,李曉軍(.南京市溧水區人民醫院檢驗科,南京 00;.東部戰區總醫院基礎醫學實驗室,南京 000)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性全身性系統性自身免疫病,典型的病理特征是滑膜炎和血管炎,主要臨床表現是遠端關節對稱性畸形和功能喪失。全世界約1%的人口受RA影響,歐洲人和亞洲人的患病率較高,確切致病機制仍未完全闡明,遺傳和環境因素具有重要作用,炎癥反應和免疫紊亂是關鍵因素[1-2]。

目前,RA診斷主要依靠臨床表現、實驗室檢查和影像學檢查,實驗室診斷標志物主要包括紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C-反應蛋白(C-reaction protein,CRP)、類風濕因子(rheumatoid factor,RF)和抗環瓜氨酸肽抗體(anti-cyclic citrullinated peptide,anti-CCP)。外泌體(exosome)直徑30～200 nm,屬于細胞外囊泡的一種,所有類型細胞均可分泌,存在于人體各種體液中,包括血清、唾液、腦脊液和尿液等。外泌體由磷脂雙分子層包裹,結構穩定,可抵抗外環境各種酶的消化,內含大量生物活性物質如蛋白質、脂類和核酸,可近距離或遠距離在相同或不同類型細胞間互相傳遞生物活性物質進行細胞間通訊[3-4]。外泌體受到廣泛關注,其所含微小核糖核酸(microRNA,miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和環狀RNA(circular RNA,circRNA)成為研究熱點。大量研究表明,外泌體中的miRNA可能作為RA診斷的潛在標志物,如miR-1915-3P、miR-187-5p等[4-6]。LncRNA是一種新發現的長度超過200個核苷酸的非編碼RNA,在不同細胞、組織、體液以及不同疾病中均具有各自特異性表達譜,主要通過影響免疫細胞的功能,發揮抑炎和促炎的雙重作用[7-8]。目前外泌體中的lncRNA在RA診斷的研究報道較少。本課題組采用基因芯片技術對RA患者血清和滑膜細胞進行lncRNA差異表達及生物信息學分析,篩選出4種差異表達的lncRNAHotair、XIST、H19和MALAT1[9-11]。本研究將探討血清外泌體攜帶的4種lncRNA可否作為RA診斷的潛在生物學標志物。

1 資料和方法

1.1研究對象 選擇2017年1月至2018年12月在東部戰區總醫院門診治療的70例RA患者,年齡31～62歲,平均年齡48.6歲,男性29例,女性41例;40例SLE患者,年齡23～65歲,平均年齡45.6歲,男性16例,女性24例。納入標準:RA患者均符合2010年美國風濕病學學會(ACR)和歐洲抗風濕聯盟(EULAR)提出的診斷標準[12],SLE患者符合ACR 2009年修訂的分類標準[13]。排除標準:患有傳染性疾病如結核、艾滋病等;患有惡性腫瘤及其他自身免疫病;患有血液系統疾病;近期使用糖皮質激素及其他免疫抑制劑藥物治療者。選擇同期40例健康體檢者作為健康對照組,30～64歲,平均年齡47.4歲,男性16例,女24例。3組年齡、性別差異無統計學意義(P>0.05)。本研究獲得東部戰區總醫院倫理委員會批準(批準文號:2016NZGKJ-049)。

1.2主要儀器與試劑 7500型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司),IMMAGE 800比濁分析儀(美國Beckman-Coulter公司),i2000型化學發光儀(美國Abbott公司),分光光度計(德國Eppendorf公司)。ExoQuick血清外泌體提取試劑盒(美國System Biosciences公司),DP315-R型RNA提取試劑盒(北京天根生物公司),SYBR?Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒、PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉錄試劑盒(上海TaKaRa公司),引物由南京銳真生物公司合成,CRP、RF檢測試劑盒(美國Beckman-Coulter公司),anti-CCP檢測試劑盒(美國Abbott公司)。

1.3標本采集與處理 用含促凝劑的真空采血管采集患者空腹靜脈血5 mL,室溫靜置30 min,3 000 r/min離心10 min。收集血清至無酶EP管中,4 ℃、12 000 r/min離心10 min,去除細胞及碎片后-80 ℃冰箱保存,用于后續外泌體提取。

1.4方法

1.4.1血清外泌體分離 將收集到的血清樣品從-80 ℃冰箱取出復溫20～30 min,4 ℃、3 000 r/min離心15 min,去除細胞碎片及雜質。每個樣本吸出250 μL血清至新的EP管中,加入63 μL ExoQuick溶液震蕩混勻15 s?；旌衔? ℃溫育30 min,4 ℃、12 000 r/min離心30 min,棄上清液,加入100 μL PBS至含有外泌體的沉淀物中,充分攪拌吹打混勻,用于下一步實驗使用。

1.4.2透射電子顯微鏡(TEM) 取按照1.4.1提取的外泌體溶液20 μL與20 μL PBS混勻,取20 μL滴在一干凈的200目載樣銅網上室溫2 min晾干,再滴20 μL 2%磷鎢酸溶液復染1 min,用干凈的濾紙輕輕吸去多余的液體晾干2 min。在南京大學公共實驗平臺使用JEM-200CX透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)拍攝外泌體圖片。

1.4.3納米粒徑追蹤儀檢測血清外泌體濃度 500 μL血清樣本按照1.4.1的方法預處理,吸取126 μL ExoQuick溶液用于提取外泌體,沉淀物懸浮于125 μL PBS中備用。Zeta View納米顆粒跟蹤分析儀(德國Particle Metrix公司)用于檢測外泌體的粒徑和濃度分析。

1.4.4RNA提取與實時定量PCR(RT-qPCR) 采用1.4.1方法提取血清外泌體,使用RNA提取試劑盒提取總RNA,操作過程參照試劑盒說明書,提取的總RNA溶解在60 μL DEPC水中,純度和濃度使用分光光度計進行測量。提取的總RNA經過RT-PCR逆轉錄為cDNA,反應體系為10 μL:2 μL 5×Prime Script Buffer,4 μL RNA模板,4 μL DEPC水;反應條件為:37 ℃ 5 min,85 ℃ 5 s,4 ℃ 10 min。GAPDH為內參基因,RT-qPCR測定lncRNAHotair、XIST、H19、MALAT1的表達量。RT-qPCR反應體系為20 μL:2 μL TB Green Premix Ex Taq Ⅱ,上、下游引物(濃度為10 μmol/L)各1 μL,12 μL DEPC水, 4 μL cDNA模板;反應條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,循環40次?；虮磉_的差異是通過2-ΔΔCt計算,其中ΔCt實驗組=Ct(目的lncRNA)-Ct(GAPDH),ΔΔCt=ΔCt實驗組-平均ΔCt健康對照組。引物序列如下表1。

表1 擴增GAPDH、Hotair、XIST、H19及MALAT1所用引物序列

2 結果

2.1血清外泌體形態檢測和納米粒徑分析 HC組、RA組和SLE組血清分離得到的外泌體分別經TEM成像顯示,外泌體形態結構完整,大小不一,為雙層膜結構包裹的橢圓形或類似圓形的納米顆粒,直徑約30～200 nm(圖1)。納米粒徑分析儀可以直觀看到做布朗運動的納米顆粒,結果顯示HC組平均粒徑為124.92 nm,RA組平均粒徑126.78 nm,SLE組平均粒徑125.7 nm,3組樣本的粒徑檢測粒徑范圍均在30～200 nm。

圖1 外泌體TEM結果

2.2血清外泌體濃度檢測 分別隨機選擇HC組、RA組和SLE組各15例患者,3組年齡和性別分布無顯著差異(P<0.05)。每個患者血清樣本取1 mL,每組分別5個樣本進行混合,然后從混合血清中分離外泌體,使用納米粒徑追蹤分析儀分別進行濃度檢測。HC組患者外泌體濃度為(3.40±0.28)×1012/mL,RA組患者外泌體濃度為(6.50±0.79)×1012/mL,SLE組患者外泌體濃度為(5.30±0.90)×1012/mL,結果顯示,RA組患者血清外泌體濃度水平顯著高于HC組(t=5.24,P<0.05),SLE組患者血清外泌體濃度水平顯著高于HC組(t=2.85,P<0.05),RA組與SLE患者之間血清外泌體濃度水平無顯著差異(t=1.42,P>0.05)。

2.3Hotair和XIST在RA患者中高表達 采用RT-qPCR方法檢測3組患者血清外泌體中lncRNAH19、MALAT1、Hotair和Xist的表達水平,lncRNAH19和MALAT1在3組中表達量低,且差異無統計學意義(P>0.05);LncRNAHotair和XIST表達水平在RA組中顯著高于SLE和HC組(P<0.001),見表2。

表2 血清外泌體中lncRNA H19、MALAT1、Hotair和Xist的相對表達水平

2.4ROC曲線分析Hotair和XIST在RA患者中的診斷價值 以HC組和SLE組作為對照組,評價2種lncRNAs對RA的診斷價值。如圖2所示,Hotair的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.84(95%CI=0.78～0.90,P<0.001),cut-off值為1.31時,敏感性為91.43%,特異性為61.25%,陽性預測值為68.82%,陰性預測值為89.47%;XIST的AUCROC為0.76(95%CI=0.68～0.83,P<0.001),cut-off值為1.65時,敏感性為65.71%,特異性為75%,陽性預測值為70.59%,陰性預測值為73.17%。

圖2 ROC曲線分析血清外泌體來源LncRNA Hotair、XIST在RA中的診斷價值

2.5Hotair和XIST的表達水平與RA患者anti-CCP、RF、ESR、CRP和DAS-28評分的關系Hotair和Xist的表達水平與ESR呈正相關,r值分別為0.646和0.640;與CRP呈正相關,r值分別為0.780和0.747;與DAS-28評分呈顯著正相關,r值分別為0.516和0.544。然而,2種lncRNA均與抗CCP或RF無顯著相關或弱相關關系。見表3。ESR、CRP水平和DAS-28評分是疾病活動的指標,因此,LncRNAHotair和Xist可能作為RA患者疾病活動的重要分子標志物。

表3 RA患者血清外泌體Hotair、XIST表達水平與實驗室相關指標及DAS-28評分的相關性分析

3 討論

人類基因組中,非編碼RNA約占據細胞總RNA的99%,lncRNA作為一種非編碼RNA,在自身免疫病中參與炎癥、異常增殖、遷移、侵襲和凋亡的過程,促進炎癥因子釋放,加重或減輕疾病的嚴重程度[8,15]。外泌體結構穩定,其所含lncRNA在多種疾病中得到鑒定,可作為預測癌癥、心血管疾病和自身免疫病等發生和發展的生物標志物[15-17]。

SLE和RA是常見的多系統自身免疫病,臨床表現、血清學特征、免疫學特征和轉錄組常具有一些相似性導致鑒別診斷存在困難[18],因此本研究選用SLE為疾病對照組。首先通過透射電鏡對提取的外泌體進行形態學鑒定,可見圓形或類圓形微小囊泡,粒徑在100 nm左右,與已有報道相符[3-4]。納米粒徑分析儀進行血清外泌體濃度分析,結果顯示RA和SLE組濃度水平顯著高于HC組(P<0.05),但RA與SLE兩組無顯著差異(P>0.05)。Shu等[19]對膽管癌、胰腺癌、普通膽管結石患者膽汁和血清中外泌體濃度進行比較,發現不同疾病之間膽汁外泌體濃度無顯著差異,胰腺癌、普通膽管結石患者血清外泌體濃度無顯著差異。因此推測外泌體濃度檢測可作為疾病狀態的判斷,不能單獨用于RA的特異性診斷。

用RT-qPCR方法分析lncRNAHotair、XIST、H19和MALAT1在3組研究對象血清外泌體中的表達水平,結果顯示H19和MALAT1均低表達且3組間無顯著差異(P>0.05),Hotair和XIST在RA組顯著高表達(P<0.001)。Song等[20]已證實Hotair可以激活成纖維細胞樣滑膜細胞和破骨細胞中的MMP-2和MMP-13,并促進骨、軟骨基質溶解和關節破壞。Bost等[21]證實XIST在RA患者成纖維細胞樣滑膜細胞和破骨細胞中過表達,促進炎癥和增殖信號通路因子表達上調。因此推測RA患者外周血清外泌體中Hoair和XIST的表達增高可能與RA患者發病機制有關。

進一步使用ROC曲線評價血清外泌體lncRNAHotair和XIST對RA的診斷價值,AUCROC分別為0.84和0.76,均具有較高的敏感性和特異性,并且兩者均與ESR、CRP和DAS-28呈正相關關系,提示2種LncRNA與RA疾病活動度存在正相關性。但本研究中缺少RA患者治療前后血清外泌體Hotair和XIST表達差異分析,無法確定藥物治療是否產生影響,下一步將進一步明確用藥前后2種血清外泌體lncRNA表達量的相互關系,從而提升診斷和預后價值。