兒茶素對阪崎腸桿菌的體外抑制作用

龔國利, 胡樂梅, 加欣宜, 齊 琦

(陜西科技大學 食品科學與工程學院, 陜西 西安 710021)

0 引言

阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)是一種無芽孢的革蘭氏陰性(G-)腸桿菌[1],兼性厭氧,有鞭毛,產黃色素,生長溫度范圍為6 ℃～45 ℃,在低濕環境更易存活.E.sakazakii屬于食源性條件致病菌,廣泛存在于環境與食品中,例如,奶粉加工設備、家用吸塵器[2]、奶粉、奶酪制品、香腸、蔬菜[3]、地表水、肥料[4]等.能引起壞死性腸炎、腦膜炎和嬰兒敗血癥等嚴重的侵襲性疾病[5].Friedemann[6]匯總發現2000～2008年間報道了超百起新生兒E.sakazakii感染病例,其感染總致死率為26.9%,其中腦膜炎、菌血癥、壞死性小腸結腸炎的致死率分別為41.9%、10%、19%.目前,食源性疾病日益成為全球公共衛生問題,其常用的防治手段是抗生素,但隨之而來的是耐藥性問題的日趨嚴重.J.Parra Flores等[7]分離的E.sakazakii及克羅諾桿菌屬均表現出對一種以上抗生素的耐藥性.因此,開發新型綠色抑菌劑是目前有待解決的問題,而植物源化合物被認為是天然抗菌劑的有效來源[8].

兒茶素,是一種多酚類化合物,屬于類黃酮類,廣泛分布于天然植物中,如茶葉等,具有抗癌,抗氧化,抗菌和抗炎等活性[9].歐凱玉等[10]和A.Renzetti等[11]研究發現,綠茶兒茶素主要抑菌途徑有:抑制毒力因子、破壞細胞膜和細胞壁、抑制胞內酶、DNA損傷以及鐵螯合等.Bhattacharya等[12]發現兒茶素可通過損傷細胞膜來抑制霍亂弧菌N16961.對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的研究中表明,表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)與細胞膜結合產生H2O2導致細胞膜損傷[13,14].研究表明,EGCG能引起大腸桿菌內源性氧化應激增加,細胞膜內部活性氧累積[14].依據GB 1886.211-2016(食品安全國家標準-食品添加劑-茶多酚)規定,兒茶素是食品添加劑茶多酚的有效成分.兒茶素可以應用在鴨肉保鮮中,鴨肉中常見的假單胞菌、李斯特氏菌、大腸桿菌、葡萄球菌以及乳酸菌等都有很好的抑制作用[15].然而目前尚未發現兒茶素對阪崎腸桿菌的抑菌效果及作用機制的相關研究.

本文通過激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)和場發射掃描電鏡(FEG-SEM)觀察兒茶素作用后E.sakazakii細胞膜完整性和細胞形態,并通過測定兒茶素對E.sakazakii的最小抑菌濃度、生長曲線、膜電位、胞內ATP水平、胞內活性氧含量和胞內pH,探究兒茶素對E.sakazakii的抑制作用和可能的機制,為兒茶素作為新型抗菌劑提供可靠的理論依據.

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)BNCC 186080,購自中國微生物菌種保藏中心,凍存于-80 ℃冰箱.

1.1.2 實驗試劑與儀器

(1)主要試劑:兒茶素(純度>98%)、DCFH-DA (上海生工生物工程股份有限公司),LB肉湯培養基、瓊脂 (北京奧博星生物技術有限公司),磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鈉、磷酸氫二鈉、葡萄糖(天津市天力化學試劑有限公司),ATP檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司),DiBAC4(3)、cFDA-SE(美國sigma公司),SYTO9/PI試劑盒(賽默飛世爾科技公司).

(2)主要儀器:THZ-98A 恒溫振蕩培養箱,TGL-20M臺式高速離心機(長沙英泰儀器有限公司),Synergy H1多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司),UV-5200 紫外分光光度計(上海分析儀器有限公司),LSM800 激光共聚焦掃描顯微鏡(德國卡爾蔡司集團),MLA650 場發射掃描電子顯微鏡(美國FEI公司).

1.1.3 試驗培養基與溶液配方

LB液體培養基:20 g LB肉湯培養基、1 L水、pH自然;LB固體培養基:20 g LB肉湯培養基、20 g瓊脂、1 L水、pH自然;PBS緩沖液:0.25 g KCl、10 g NaCl、0.3 g KH2PO4、1.8 g Na2HPO4、1 L水,pH 7.2-7.4.

1.2 實驗方法

1.2.1 兒茶素對E.sakazakii的最小抑菌濃度測定

將凍存于-80 ℃的E.sakazakii接種于LB固體培養基,37 ℃培養過夜,挑取1-2個單菌落,接種于LB液體培養基中,37 ℃,180 rpm培養至菌體的對數生長期,得到菌懸液.

采用微量肉湯稀釋法測定兒茶素對E.sakazakii的最小抑菌濃度(Minimum inhibition concentration,MIC).取菌懸液與兒茶素溶液各100 μL至96孔微量培養板中混合.兒茶素通過二倍稀釋法獲得,終濃度分別為0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL,以終濃度為1 mg/mL的氨芐青霉素鈉為陽性對照,PBS處理為陰性對照.37 ℃,180 rpm培養8 h后,用酶標儀測定在600 nm處的菌體密度值.

1.2.2 兒茶素對E.sakazakii生長曲線的影響

按1.2.1中方法得到E.sakazakii菌懸液,將100 μL菌懸液加入到96孔微量培養板中,再加入不同濃度的兒茶素,使其終濃度為2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC、1/32 MIC、1/64 MIC.以PBS處理做對照,每小時用多功能酶標儀在600 nm處測定菌體密度值,共監測24 h.

1.2.3 兒茶素對E.sakazakii細胞形態的影響

按1.2.1中方法得到E.sakazakii菌懸液,離心(8 000 rpm,5 min,4 ℃)收集細胞,用PBS溶液洗滌兩次,用MIC和2MIC的兒茶素溶液重懸菌體,PBS溶液處理作為對照,于37 ℃,180 rpm培養4 h,洗滌兩次后收集菌體沉淀.加入2.5%的戊二醛溶液,4 ℃靜置12 h.洗滌兩次,分別在30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇水溶液中靜置脫水10 min.離心,用乙酸異戊酯重懸后,-20 ℃冷凍30 min.將樣品進行冷凍干燥后固定在載物臺上.濺射噴金后,在FEG-SEM下觀察.

1.2.4 兒茶素對E.sakazakii細胞膜完整性的影響

按1.2.3中方法得到兒茶素處理后的E.sakazakii菌體沉淀,用PBS溶液重懸,加入3 μL SYTO9/PI混合染料,避光孵育30 min,用PBS溶液洗滌2次菌體后重懸.吸取菌懸液滴于載玻片上,在CLSM下觀察.

1.2.5 兒茶素對E.sakazakii細胞膜電位的影響

按1.2.3中方法得到兒茶素處理后的E.sakazakii菌體沉淀,用PBS溶液重懸并加入3 mM DiBAC4(3)膜電位熒光探針,黑暗孵育2 h.分別吸取200 μL加入到96孔微量培養板中,測量熒光強度(激發波長492 nm,發射波長515 nm).

1.2.6 兒茶素對E.sakazakii胞內ROS水平的影響

按1.2.3中方法得到兒茶素處理后的E.sakazakii菌體沉淀,加入10 mM的熒光探針DCFH-DA重懸,避光孵育1 h后,經PBS緩沖液洗滌兩次并重懸,將200 μL菌懸液加入黑色96孔微量培養板中,使用多功能酶標儀在激發和發射波長分別485 nm和535 nm時測量熒光強度.

1.2.7 兒茶素對E.sakazakii胞內ATP的影響

按1.2.3中方法得到兒茶素處理后的E.sakazakii菌體沉淀,經PBS緩沖液洗滌兩次,用ATP檢測試劑盒測定.

1.2.8 兒茶素對E.sakazakiipHin的影響

按1.2.1中方法得到E.sakazakii菌懸液,離心(8 000 rpm,5 min,4 ℃)收集菌體沉淀,用PBS緩沖液清洗兩次.在10 mL的磷酸鉀緩沖液中重新懸浮細胞顆粒,加入3 mM cFDA-SE分子探針.37 ℃振蕩孵育20 min,用PBS緩沖液滌兩次,再加入葡萄糖(終濃度10 mM),孵育0.5 h,最后將E.sakazakii細胞洗兩次,置于冰上備用.用PBS緩沖溶液配置兒茶素溶液(0、MIC、2 MIC),分別重懸上述所得細胞,在黑暗條件下孵育1 h,在黑色96孔微量培養板中加入200 μL孵育后的溶液,測量熒光強度,激發波長440 nm/490 nm,發射波長520 nm.

2 結果與討論

2.1 兒茶素對E.sakazakii的最小抑菌濃度

測定MIC來確定兒茶素對E.sakazakii的抑菌活性,其結果如圖1所示.由圖1可知,兒茶素濃度≥2 mg/mL時,E.sakazakii的生長被明顯抑制,比陽性對照組吸光度值更低.表明兒茶素對E.sakazakii的MIC為2 mg/mL.

圖1 兒茶素對E.sakazakii的最小抑菌濃度

2.2 兒茶素對E.sakazakii的生長曲線

為了準確反映出細菌在24 h內的整體生長情況,測定兒茶素對E.sakazakii的生長曲線,其結果如圖2所示.由圖可知,當濃度≥1/4 MIC時,相較于對照組在前3 h內激增,E.sakazakii的生長受到抑制;相較于對照組在7 h后的穩定繁殖,當濃度≥1/2 MIC的細菌在3 h后進入平穩期,細菌生長受到明顯抑制,菌濃降低了約59.09%(24 h,對照組OD600≈0.88,1/2 MIC處理OD600≈0.36);當濃度≥MIC時,E.sakazakii生長顯著抑制,菌濃降低了約87.5%(24 h,對照組OD600≈0.88,MIC處理OD600≈0.11).綜上,兒茶素對E.sakazakii的抑制呈濃度依賴性,且可以有效干擾菌體增殖.

2.3 兒茶素對E.sakazakii細胞膜完整性的影響

為了直觀觀察E.sakazakii的細胞膜是否損傷,采用SYTO9和PI兩種熒光染料進行染色觀察.觀察結果顯示,對照組樣品在紅色熒光通道中熒光稀少(圖3 (b)),說明細胞完整性較好,PI染料無法進入細胞.經MIC濃度兒茶素處理后,部分細胞在紅色熒光通道中出現紅色熒光(圖3 (e)),說明部分細胞發生膜損傷,PI得以進入細胞.2 MIC處理組紅色熒光進一步增強,疊加通道中部分細胞發出黃色和紅色熒光(圖3(i)).結果表明,兒茶素通過損傷E.sakazakii細胞膜來達到抑菌效果.

圖3 兒茶素對E.sakazakii細胞膜完整性的影響

2.4 兒茶素對E.sakazakii細胞形態的影響

使用FEG-SEM觀察E.sakazakii膜表面形態發現,未經處理的對照組細胞表面光滑完整,細胞飽滿,細胞膜完整(圖4(a));MIC濃度的兒茶素處理后E.sakazakii細胞表面輕微皺縮,細胞膜表面出現損傷(圖4(b));2 MIC濃度的兒茶素處理過的細胞產生了粘連,表面凹陷出現孔洞,細胞膜產生破損(圖4(c)).以上結果表明,兒茶素可以通過破壞E.sakazakii的細胞膜,來影響菌體的正常增殖.

圖4 兒茶素對E.sakazakii的細胞形態影響

2.5 兒茶素對E.sakazakii細胞膜電位的影響

DIBAC4(3) 分子探針能夠在細胞內與胞漿中的蛋白質結合,通過其發光強度的改變,來判斷細胞膜有無受損.如圖5 所示,經兒茶素處理后,E.sakazakii的膜電位明顯增強,MIC濃度相較于對照組細胞膜電位提高了24.79%(對照組-21 471,MIC處理組-16 147.5),而當用2 MIC濃度處理后,膜電位提高了51.96%(對照組-21 471,2 MIC處理組-10 315.5).結果表明兒茶素可引起E.sakazakii細胞膜的去極化,最終使得細胞生長繁殖被抑制.

圖5 兒茶素對E.sakazakii細胞膜電位的影響

2.6 兒茶素對E.sakazakii胞內ROS水平的影響

ROS水平的激增反映的是細胞的氧化應激,熒光探針DCFH-DA在細胞內可以將ROS代謝產物轉化成可檢測的DCF.如圖6所示,與對照組相比,細胞內的ROS水平通常維持在較低水平,經兒茶素處理后,E.sakazakii胞內ROS過量,細胞的熒光強度顯著增加.MIC處理組增加了4.72倍(對照組140.67,MIC處理組804.67),2MIC處理組增加了5.12倍(對照組140.67,2MIC處理組860.33).結果表明兒茶素引起了E.sakazakii中ROS的積累,從而使細胞出現氧化損傷.

圖6 兒茶素對E.sakazakii胞內活性氧的影響

2.7 兒茶素對E.sakazakii 胞內ATP的影響

胞內ATP水平是評估細胞生長的關鍵性指標.如圖7所示,與對照組相比,兒茶素(MIC和2 MIC)處理的E.sakazakii細胞內ATP濃度顯著降低(p≤0.01),MIC處理組降低了4.93倍(對照組272.67,MIC處理組46),2 MIC處理組降低了5.29倍(對照組272.67,2 MIC處理組43.33).結果表明,兒茶素處理后E.sakazakii胞內ATP下降,可能是胞內ATP發生泄漏,也可能是代謝紊亂導致細胞ATP合成受阻.

圖7 兒茶素對E.sakazakii 胞內ATP的影響

2.8 兒茶素對E.sakazakii pHin的影響

pHin的變化是膜完整性的一個重要指標.cFDA-SE是一種不自發發光的pHin分子探針,當其被內源性的酯酶分解時,就會產生熒光,測量其在490與440 nm處的相對熒光強度比值與pH呈線性關系(pHin的校準曲線:y=0.734 1x+0.245 1,R2=0.990 7).

由圖8可知,與對照組相比,兒茶素處理后的菌體相對熒光比值顯著下降,MIC處理組降低了45.63%(對照組3.20,MIC處理組1.74),2 MIC處理組降低了48.75%(對照組3.20,2 MIC處理組1.64);兒茶素處理后的E.sakazakiipHin值顯著下降,MIC處理組降低了30.26%(對照組5.75,MIC處理組4.01),2 MIC處理組降低了32.35%(對照組5.75,2 MIC處理組3.89).結果表明,經兒茶素處理后的E.sakazakii細胞膜通透性發生變化.

圖8 兒茶素對E.sakazakii pHin的影響

3 結論

本研究通過CLSM和FEG-SEM觀察細胞形貌,利用膜電位、胞內ATP、pHin以及ROS的測定來探究細胞膜通透性.所得結論如下:

(1)兒茶素對E.sakazakii有良好的抑菌效果,其MIC濃度為2 mg/mL.經CLSM和FEG-SEM觀察,直觀地發現MIC濃度下E.sakazakii細胞膜出現表面塌陷和變形,通透性發生改變.

(2)細胞膜電位熒光強度增強表明其發生了去極化,說明E.sakazakii細胞膜通透性發生改變,細胞增殖受到了抑制.

(3)經兒茶素處理后,ROS的累積表明細胞發生氧化應激,E.sakazakii細胞膜出現了氧化損傷.

(4)經兒茶素處理后,E.sakazakii的胞內ATP和pHin都有明顯的下降,表明兒茶素可能會引起E.sakazakii的細胞膜通透性改變,從而導致胞內成分出現泄漏,或是細胞代謝紊亂,導致ATP合成途徑受阻.

本研究結果可為兒茶素的開發和利用提供理論依據.