礦化膠原材料的制備、調控及礦化機制研究進展

田振華, 趙文杰, 高盼盼, 何靜瑄

(1.陜西科技大學 輕工科學與工程學院, 陜西 西安 710021; 2.陜西科技大學 輕化工程國家級實驗教學示范中心, 陜西 西安 710021; 3.興業皮革科技股份有限公司, 福建 泉州 362000)

0 引言

近年來,隨著我國人口老齡化和飲食結構的改變,與骨相關的健康問題日漸凸顯,比如骨缺損、骨質疏松.雖然自體骨存在一定的自修復功能,但對于骨內富集或殘留毒素引起的骨髓壞死或干細胞分化干擾、大尺寸的骨缺損、骨質疏松等問題,自體骨因其較低的內源性自我修復能力不能實現完全修復,這些硬組織損害和疾病所帶來的危害往往是不可逆的[1].因此為了保證骨組織快速再生并恢復其失去的功能,需要硬組織替代生物材料的植入輔助骨修復作用[2].

骨組織是一種復雜的生物礦化材料,具多級微納米結構,其基本單位是由有序的Ⅰ型膠原纖維和羥基磷灰石(HAP)組成的礦化膠原支架.其中,Ⅰ型膠原構成骨支架并賦予其彈性與韌性;HAP作為無機質,提供剛度[3,4];此外,膠原纖維所具有的多重原纖結構為骨組織的等級結構奠定了基礎,HAP和膠原纖維在分子水平上呈現有機-無機界面的識別和嵌合,這種嚴格的等級結構和不同元素的緊密相互作用構成了更優越的機械性能[5].天然骨組織所具有的獨特形態和功能,為仿生礦化膠原材料的開發提供了示范.

膠原纖維具有獨特的四分之一錯列結構,纖維軸向上首尾相鄰的分子間存在約40 nm的空隙區,平行排列的分子間存在0.24 nm的間隙.在礦化膠原材料的制備過程中,此結構作為模板,引導無機質有序沉積在膠原纖維內的這些空隙中并進一步結晶與生長,沿纖維長軸排列形成有序的分級層次結構(如圖1所示)[6-9].礦化膠原材料具有與天然骨骼相類似的多級結構,可為骨細胞提供合適的微環境,且膠原具有促進骨細胞黏附、遷移、增殖和分化等生物學功能,有利于新骨的形成且其三維立體結構可為新骨的生長提供支架[10];作為骨組織代謝所必須的營養成分,能為骨修復提供能量和原料,其高孔隙率有利于承載細胞與信號分子并保證養分的傳輸和廢物的排泄通暢[11];可根據需要加工成各種形狀和大小,手術中易于修整,具有一定的機械強度,在必要時材料本身可提供機械支持.此外,礦化膠原材料還具有低免疫原性、良好的生物相容性及生物可降解性等優勢,作為修復骨缺損和促進骨融合的骨修復材料具有廣闊的應用前景,成為了當前生物礦化領域及骨修復領域的關注點[12].

圖1 膠原纖維的結構及膠原纖維內礦化示意圖[9]

在膠原礦化過程中,需要三大因素參與:膠原纖維作為礦化模板提供支架結構;礦化液作為無機質形成的主體原料;非膠原蛋白(NCPs)及其類似物作為誘導劑穩定并誘導礦化液的浸潤與沉積.基于此,目前對于礦化膠原材料的研究重點在于新型礦化膠原材料的開發、礦化膠原材料結構的調控以及礦化機制的探索.例如,礦化材料已從最初的鈣化膠原擴展到硅化、鐵化膠原等;誘導劑種類、用量及礦化pH等因素對膠原的礦化過程、礦化程度等有所影響.因此,本文綜述了礦化膠原材料的種類及制備,并對其礦化過程中的調控因素和機制作了闡述,就該材料的研究方向及其在骨修復領域中的應用前景進行了簡要的討論與展望.

1 礦化膠原材料的種類及其制備

最初,對于礦化膠原材料的研究主要集中于對天然骨成分及結構的仿生,通常是利用無定形碳酸鈣或磷酸鈣前體失水在纖維內或纖維外實現礦化所得到的鈣化膠原材料.隨著礦化技術及機制的發展,研究者們為了賦予礦化材料更多的功能性(如促成骨作用[13]、抗菌性[14]、組織誘導性[15]等),不斷擴大無機質的選擇范圍、尋求新型誘導劑或創新制備方法.在礦化膠原材料的制備中,無機質從HAP逐漸發展到硅、鈦等其他無機材料,誘導劑由最初的NCPs及其類似物如骨鈣素、聚天冬氨酸(PAsp)、聚丙烯酸(PAA)擴充至天然多糖如海藻酸鈉、硫酸軟骨素、羧甲基殼聚糖等,使得礦化材料種類多樣化、功能豐富化.目前礦化膠原材料主要包括鈣化[16,17]、硅化[18-21]、鈦化[22]、鋯化[15]、鐵礦化[23-25]以及多相礦化[26,27]膠原.

1.1 鈣化膠原材料

受天然骨成分的啟發,鈣化膠原材料即HAP礦化膠原對成骨細胞的表達起著一定作用,是骨修復材料最有潛力的候選生物材料之一,也是至今研究最多的一類礦化膠原材料.研究者們最初均以膠原/HAP材料為基礎對礦化膠原材料的制備方式以及礦化機制進行探討.因此模擬天然骨的成分和結構特征在體外制備鈣化膠原材料是當前發展礦化膠原材料的基石[28].

膠原/HAP復合材料制備通常有兩種方式,其中一種是直接將膠原浸泡在模擬體液(SBF)中用于提高植入物的生物相容性;另一種是將膠原纖維和鈣磷鹽共沉淀自組裝制備,使得鈣化膠原材料具有與骨相同的層次結構.SBF溶液以及鈣磷鹽雖然提供了礦化所需要的離子資源,但HAP在纖維內的形成是不可控的,通常需加入適當的誘導劑以穩定前驅體溶液,進而誘導HAP在膠原纖維內部沉積形成纖維內礦化[29].常用誘導劑主要有NCPs類似物如PAsp、PAA、聚谷氨酸等,此類物質含有大量的羧基,可結合鈣離子以防止前驅體溶液發生纖維外沉淀而促進纖維內礦化.其中,PAsp是應用最廣泛的鈣化誘導劑.Bradt等[30]采用膠原自組裝與磷酸鈣形成同步法制備了鈣化膠原纖維并首次指出PAsp可改善膠原纖維與磷酸鈣晶體之間的附著,在促進纖維內礦化中具有重要作用.

除上述NCPs類似物外,帶有大量負電荷基團的生物大分子(如海藻酸鈉、羧甲基纖維素)亦可作為誘導劑.Su等[31]將不同量的NaH2PO4和CaCl2依次滴入膠原/海藻酸鈉混合液成功制備鈣化膠原材料,并研究了海藻酸鈉的作用.結果表明海藻酸鈉不僅可以捕獲Ca2+并且可促使膠原纖維的橫向聚集;當海藻酸鈉存在且HAP的理論含量為60%時,實現了纖維內礦化且效果最好,鈣化膠原材料具有最佳的機械性能,有望應用于骨再生領域.

1.2 硅化膠原材料

硅礦化支架最早發現在海洋玻璃生物體中,為后續合成有機-納米硅復合材料開辟了新的道路[32].其中,硅元素是人體內的主要微量元素,而二氧化硅(SiO2)納米顆粒具有潛在的刺激骨相關基因表達和細胞增生的能力.

在硅基膠原復合材料開發初期,其主要以硅-膠原雜化體的形式存在.Coradin等[33]選用硅酸鹽溶液作為前驅體溶液,與膠原溶液共混后在氨蒸汽下凝膠化合成了膠原-硅生物雜化體,發現硅酸鹽和膠原濃度對產物形態具有很大影響;當硅酸鹽與膠原的濃度分別為15 mg/mL和5 mg/mL時,可形成同質均勻的膠原/SiO2纖維.然而,膠原的自組裝動力學和SiO2聚合動力學并不完全兼容,使得材料穩定性和可控性較差.Niu等[13]選用氯化膽堿穩定的硅酸作為前驅體溶液、經聚(烯丙胺)鹽酸鹽(PAH)處理過的膠原纖維為模板,成功實現了SiO2納米顆粒在膠原纖維內的礦化沉積.該硅化膠原材料具有促成骨和血管增長的潛力,但缺乏細胞歸巢、可生物降解性及高度相容性.后續研究中,作者在硅化過程中同步引入了基質細胞衍生因子SDF-1,不僅解決了上述問題,而且消除了細胞播種或補充成骨和血管生成生長因子的需要,該成果為原位硬組織再生提供了新的治療方案[21].

1.3 鈦化膠原材料

納米二氧化鈦(TiO2)具有良好的生物相容性、骨傳導能力和優良的機械性質,可誘導HAP沉積,是機體發生骨整合的活性成份[34].利用仿生礦化的方法將TiO2引入膠原材料,有望制備具良好性能的骨修復材料.

許譯文[22]采用具有催化硫酸氧鈦水解和縮合作用的聚乙烯亞胺(PEI)預交聯膠原,促使TiO2在膠原纖維內的沉積,成功制備了鈦化膠原支架.TiO2通過表面羥基化誘導HAP的形成,賦予鈦化膠原骨傳導效應,有利于增強骨修復材料的再生能力以及縮短臨床愈合時間.

1.4 鋯化膠原材料

鋯(Zr)是人體骨骼與組織的微量元素之一.研究發現Zr離子具有促成骨細胞增殖分化的作用,其氧化物即氧化鋯(ZrO2)或金屬合金復合支架在骨種植領域有潛在的應用前景[35].例如,ZrO2陶瓷材料不僅具有良好生物相容性和耐腐蝕性,而且以其機械強度和光學性能的非凡而聞名,廣泛應用于人體組織修復領域,尤其是牙種植體.

Zhou等[15]采用乙酰丙酮抑制、釔穩定的氧化鋯(YSZ)作為前驅體溶液,PAH交聯膠原支架作為模板,借助PAH和膠原纖維中的水分子觸發YSZ的水解縮合使無定形ZrO2納米顆粒沉積在纖維內形成鋯礦化膠原材料.如圖2所示,YSZ進入膠原纖維后在PAH作用下聚結,形成尺寸更大的無定形前體聚集體;隨后這些聚集體在水的催化下縮聚轉變為無定形ZrO2納米顆粒,沉積于膠原纖維內空隙中.該研究為開發融合具高機械強度氧化鋯的天然膠原材料提供了新策略,具有作為人體受損硬組織替代物的潛在應用價值.

圖2 YSZ在膠原纖維內沉積的過程示意圖[15]

1.5 鐵礦化膠原材料

含鐵礦物在細菌、藻類、軟體動物、昆蟲和脊椎動物體中廣泛存在.鐵作為金屬元素,一是依靠地磁場為進行生命或生理活動的生物提供“導航”;二是生物體可以吸收其轉化為強化和保護自身器官或組織的化合物.常見的含鐵礦物分為氧化物(磁鐵礦)和氫氧化物(針鐵礦、纖鐵礦(γ-FeOOH)、水鐵礦等).

目前,鐵礦化膠原材料的研究主要集中于纖鐵礦化類膠原材料.Xu等[23]將膠原海綿直接浸泡于FeCl3、FeCl2和PAsp溶液后置于飽和氫氧化銨環境中礦化24 h.經透射電鏡觀察僅有少量γ-FeOOH納米顆粒存在于膠原纖維表面,而大部分存在于纖維外.隨后,Oosterlaken等[24]采用仿生共沉淀法將堿滴定后的FeCl3和FeCl2溶液、PAsp溶液與膠原分散液依次混合制備了鐵礦化膠原,PAsp存在時可發生纖維內礦化,反之則為纖維外礦化.礦化過程中首先形成Fe-PAsp復合物,隨后轉化為γ-FeOOH貫穿在膠原纖維內部.該礦化機制類似于HAp礦化膠原的機制,進一步證實了膠原纖維可以作為礦化的通用模板,但該方法下所觀察到的γ-FeOOH晶體不成熟.后續研究中,Oosterlaken等[25]研究了原料加入方式、pH值、氧化等因素對鐵礦化膠原的影響規律,發現先通過KOH溶液調節FeCl2溶液的pH至9合成Fe(OH)2中間體,再將其引入膠原纖維與PAsp混合液中,經氧化后可獲得含有成熟γ-FeOOH晶體的礦化膠原纖維.此研究為鐵礦化膠原材料的開發提供了理論指導,具有較高的參考價值.

此外,磁鐵礦和磁鐵礦基材料在癌癥診斷和治療中具有熱療、藥物轉運和靶向傳遞等優勢[36],也有文獻曾報道膠原/HAP/磁鐵礦復合材料具有抗腫瘤、促進骨再生等作用,可用于骨癌治療[37].

1.6 多相礦化膠原材料

自然界中天然生物礦化材料除單相礦化外,有些稀有生物的結構層次是由多相礦化組合而成,如軟體動物的硅-幾丁質-針鐵礦齒舌、腕足類動物的硅-幾丁質-磷灰石殼、橈足類動物的硅-幾丁質-硅鋅礦牙齒[38,39],此類礦化形式為新型多相礦化生物復合材料的開發提供了靈感.

Niu等[26]和Jiao等[27]將膠原支架依次浸泡于PAH穩定的硅酸、PAsp穩定的無定形磷酸鈣礦化液(ACP)中,制備了雙相SiO2/磷灰石共礦化膠原支架,并進一步研究了該材料在硬組織再生中的生物學應用.結果表明SiO2和磷灰石不僅賦予了膠原支架機械性能,而且在骨代謝中發揮了更具生物活性的協同作用.雙相礦化材料刺激骨髓間充質干細胞的成骨分化的同時抑制了破骨細胞的生成.多相礦化膠原材料可集多種無機質的生物功能為一體,為多功能性礦化膠原的材料的開發提供了新的思路.

傳統的礦化膠原材料制備工藝主要是利用誘導劑對礦化液進行穩定并誘導其進入膠原纖維內部,水解縮聚實現礦化.隨著礦化液種類、誘導劑種類的增多及現有礦化技術的發展,制備工藝出現了轉變,新型的制備工藝可分為以下兩種:(1)膠原溶液先與礦化液、誘導劑共混,隨后膠原的組裝成纖過程與礦化液的水解縮聚過程同步化,實現礦化[19,24,31]; (2)誘導劑先進入膠原纖維內部,隨后再浸入礦化液實現礦化[13,15,22].然而,這兩種工藝的普適性不及傳統制備工藝;此外,礦化膠原材料的種類與制備工藝之間的對應關系、制備工藝對最終礦化膠原材料的結構與性能產生何種影響尚無明確的規律性結論,需進一步探究.

2 礦化過程中的調控因素

膠原纖維的礦化主要依賴于誘導劑穩定礦化液,控制其尺寸并誘導其進入膠原纖維內部實現礦化.因此,礦化液、誘導劑及礦化條件對膠原的礦化過程具有顯著的調控作用.

2.1 礦化液濃度

在膠原礦化過程中,在誘導劑的作用下礦化液進一步結晶或者水解縮聚形成礦物沉積在膠原纖維內.礦化液的濃度會影響所形成礦物質的形貌及沉積量,進而影響礦化材料的性能.

Zhao等[40]將膠原/殼聚糖支架先分別浸泡于0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.25 mol/L、0.5 mol/L CaCl2溶液,再分別滴入不同濃度(0.03 mol/L、0.06 mol/L、0.1 mol/L、0.3 mol/L)的 (NH4)2HPO4溶液,制備了礦化膠原/殼聚糖支架并檢測了其微觀結構與性能.結果表明,當CaCl2濃度為0.05 mol/L,HAP呈現針狀;隨CaCl2濃度的增加,HAP呈球形且粒徑從100 nm增加至200 nm.此外,隨CaCl2濃度的增加,材料中HAP含量提高,進一步使得材料的熱穩定性與儲能模量提高.

2.2 誘導劑

誘導劑(NCPs及其類似物)不但對礦化前驅體溶液有穩定作用,而且進一步誘導其滲入膠原纖維內部發生結晶、完成纖維礦化,在膠原纖維礦化過程中的作用舉足輕重.鑒于NCPs富含羧基的特性,許多陰離子型化合物如PAsp[41]、PAA[42]、檸檬酸鹽[43]、羧甲基殼聚糖[44]、海藻酸鈉[31]、硫酸軟骨素[45]等可作為NCPs類似物調控體外生物礦化過程.而誘導劑的種類、濃度、分子量等均會對礦化行為產生不同影響.

2.2.1 誘導劑種類

骨橋蛋白(OPN)是一類含有重復天冬氨基酸殘基序列的NCPs,廣泛存在于骨的細胞外基質中,與骨的形成和發展密切相關.Saxena等[46]評估了OPN和PAsp對膠原礦化的影響.研究發現,OPN存在時,膠原海綿在礦化6 h時存在大量的礦物(62.9%±2.1%);而PAsp存在時,海綿的礦化速度較慢,6 h時礦物含量僅有14.2%±2.1%,在18 h時才能達到與OPN相接近的礦物質含量.由此可知,OPN能更快、更均勻地誘導磷灰石的形成且膠原纖維內礦化程度較高,在加工仿生骨替代品方面有更顯著的優勢.

2.2.2 誘導劑濃度

檸檬酸可以有效補充骨密度,是一種廣泛用于骨質疏松癥的藥物.礦化膠原中檸檬酸的作用體現在改善骨生成和骨相關疾病的治療.Shao等[47]通過比較不同濃度檸檬酸鹽對膠原礦化程度的影響,研究了檸檬酸鹽促骨形成的機理.如圖3所示,檸檬酸鹽不僅提供了羧基成核位點和磷酸鈣礦物相的結合位點,而且可通過減少ACP與膠原間的界面能以促進異相成核,增強了膠原和無機相的整合及礦化程度.當檸檬酸鹽濃度接近天然骨膠原中檸檬酸水平即超過8 wt%時,礦化膠原中HAP與膠原的重量比接近3.0,達到天然骨骼的水平,且該濃度下膠原纖維達到了完全潤濕(如圖3所示);相比之下,未進行處理的膠原中HAP與膠原的重量比僅為2.5.因此,檸檬酸鹽的加入增加了礦化膠原中的總礦物質HAP含量,可顯著提高膠原的礦化程度.

圖3 檸檬酸鹽濃度對膠原礦化程度的影響[47]

2.2.3 誘導劑分子量

Shen等[42]研究了PAA分子量(2 kDa、100 kDa、450 kDa)和濃度(40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L)對膠原礦化的影響.結果表明膠原的礦化程度雙重依賴于聚合物的分子量和濃度(如圖4所示).低濃度的高分子量PAA無法穩定ACP導致纖維外礦化,高濃度的低分子量PAA的穩定作用過強導致礦化速率過慢.只有在低濃度的2 kDa PAA和較高濃度的100 kDa和450 kDa PAA下才能有效延緩ACP的結晶,從而誘導纖維內礦化;此條件下,礦化膠原中HAP含量達到約40%,與天然骨中礦物含量相近.此外,礦化材料中所含Ca和P含量隨著PAA分子量的提高或PAA濃度的降低而增加,但其Ca/P比范圍為1.63 ～ 1.74,與天然骨(1.67)相近.

圖4 PAA分子量和濃度對膠原礦化的影響[42]

2.3 礦化條件

2.3.1 礦化pH值

鑒于部分NCPs及其類似物的兩性聚電解質特性,pH值對于調節膠原礦化有重要的作用.例如,羧甲基殼聚糖(CMC)作為兩性聚電解質同時具有羧基和氨基,可分別作為低于或高于其等電點的陰離子或陽離子聚電解質.

CMC作為兩性聚電解質同時具有羧基和氨基,可分別作為低于或高于其等電點的陰離子或陽離子聚電解質.Lin等[48]發現帶負電荷的CMC(pH 7)捕獲ACP溶液中帶正電荷的Ca2+穩定ACP納米粒子,并通過膠原先組裝后礦化的模型促進纖維礦化,符合傳統所認可的MFS礦化機制(如圖5所示);而當pH值為2時,帶正電荷的CMC捕獲ACP溶液中帶負電荷的磷酸根離子來穩定ACP納米粒子,然后通過同步自組裝/礦化的方式整合在膠原纖維內,此礦化機制(SSM模型)的發現為開發礦化膠原支架材料提供了一種新的策略.

圖5 礦化液在不同pH下的膠原礦化示意圖[48]

2.3.2 礦化時間

膠原礦化是一個受時間調控的過程,該過程包括前驅體溶液浸潤膠原纖維以及礦物結晶沉積在纖維內.Dai等[49]借助三聚磷酸鈉的負電性與帶正電的膠原間隙相結合,產生了相應的礦化位點,利用PAA誘導膠原纖維產生了周期性的纖維內礦化.如圖6所示,24 h前是ACP浸潤階段,表現為磷酸鈣前核簇周期性附著在膠原纖維表面(開放箭頭);48 h發生了部分礦化,可檢測出低結晶磷灰石;72 h后,具有周期性纖維內磷灰石沉積的礦化膠原纖維形成.表明膠原礦化是一個受時間調控的過程,隨著時間的推移,礦物質的密度越大,礦化效果越明顯.

圖6 不同礦化時間下膠原纖維的TEM圖[49]

在膠原纖維的礦化過程中,可根據多重因素的不同作用調控膠原的礦化程度、元素的含量及比例從而得到不同性能的礦化膠原材料.然而,目前對于膠原礦化的調控因素主要集中于礦化液和誘導劑.膠原模板雖然作為礦化所必需的三大因素之一,但目前關于膠原纖維結構如膠原直徑等對膠原礦化過程的影響未有系統性的研究,有待進一步探討.

3 膠原纖維的礦化機制理論

生物礦化是一個普遍存在且嚴格調控的過程,它為骨骼創造了層次結構.了解膠原纖維礦化的原理、過程、調控機制,對骨組織再生材料的設計具有重要意義.目前所概括出的礦化機制有:NCP誘導的外延成核理論、聚合物誘導的液體前驅體理論、尺寸排阻理論、靜電吸引理論、吉布斯塘南平衡理論.

3.1 NCP誘導的外延成核理論

NCPs是存在于礦化組織細胞外基質中的一種非膠原蛋白,如骨鈣素、骨橋蛋白、牙本質基質蛋白等,在礦化基質中對晶體成核和生長過程起著促進或抑制的作用.最初,Hoang等[50]只對天然骨鈣素與晶體的作用進行了研究,發現骨鈣素可以通過其三維構象與特定晶體間的外延調節溶液中晶體的生長;然而,這些外延關系是基于有序HAP晶格的結構建模計算的,而并非基于骨中結晶不良的碳酸磷灰石.因此,NCP誘導的外延成核形成礦化膠原纖維的假說尚未完整.

天然或重組NCPs直接用于仿生領域中在經濟方面不太現實且存在易降解、純度不高等弊端.因此,研究者根據質子化NCPs帶負電的特征尋找了成分單一、合成簡單、價格便宜的NCPs類似物——聚陰離子并對其穩定或者誘導前驅體的作用進行了探索,在膠原礦化過程做出了不少貢獻.同時,提出了持不同觀點的礦化機制.

3.2 聚合物誘導的液體前驅體機制(PILP)

Olszta等[51]利用掃描電鏡對礦化膠原進行觀察,根據礦物相浸潤膠原的程度判斷礦化過程,提出了聚合物誘導的液體前驅體機制(PILP).膠原礦化過程是通過液相非晶態前驅體溶液滲入纖維內部再結晶,即在礦化液中鈣離子和聚合物發生結合用以隔離鈣離子和碳酸根離子、抑制成核,形成中間液相核前簇,再轉變為固體非晶態物質最后轉化成結晶碳酸鈣,實現一個多步結晶過程.

基于最初的實驗結果只是成功地證明了礦物前驅體可以浸潤膠原纖維并且也只針對碳酸鈣礦物,而磷酸鈣才是骨自身的礦物質;此外,對于前驅體溶液進入膠原纖維的機制還暫不明確.因此,為進一步闡明骨形成過程中膠原如何實現纖維內礦化,Olszta等[52]研究了PAsp穩定的ACP在礦化膠原纖維過程中的礦物滲透機理、非晶態向晶體的轉變、纖維內晶體排列機理等,認為礦化分為三個過程:(1)帶負電荷的聚合物抑制成核,同時在結晶溶液中液相前驅體與周圍的水分產生液液相分離,形成高度水合的非晶態磷酸鈣相的納米液滴;此納米液滴吸附在膠原纖維上,并由于其流體特性通過毛細管作用進入膠原纖維的孔區和間隙(如圖7(a)所示);(2)膠原纖維被無定形的礦物前驅體浸潤的同時失去結合水(如圖7(b)所示); (3)非晶態前體逐步轉變為固體非晶相最后結晶形成HAP納米晶體嵌入膠原纖維內(如圖7(c)所示).上述“毛細管滲透機制”的提出對“PILP理論”進行了充分補充.

圖7 PILP礦化機制示意圖[52]

這一假說很好地解釋了生物礦化過程中存在無定形中間相的事實,逐漸替代了“NCP誘導的外延成核理論”,被廣泛用于解釋各種仿生礦化和生物礦化現象.

3.3 尺寸排阻理論

膠原纖維具有半透膜性質,可以選擇性地排阻大于40 kDa的分子.雖然被排除在纖維外,但它們可以通過部分擴散到原纖維中的小磷灰石晶體核來啟動礦化或者通過抑制除原纖維內以外的任何地方的磷灰石生長來觸發原纖維內礦化.胎兒蛋白是一種分子量為48 kDa的大分子血清蛋白,也是天然骨中含量最豐富的NCPs之一,但其分子量較大被膠原纖維排除在外.最初,Toroian等[53]探究了胎兒蛋白誘導膠原礦化的作用,發現在膠原纖維外部磷灰石形成過程中,部分可能產生小的晶體核,這些高達12個單位細胞大小的磷灰石晶體隨后擴散到原纖維內并生長成較大的磷灰石晶體,而存在于纖維外的胎兒蛋白可能與殘留在纖維外溶液中的晶體結合,從而確保只有纖維內的晶體生長.提出膠原纖維礦化有可能依賴于排除在纖維外的分子量較大的胎兒蛋白.

后續實驗中,為了進一步了解胎兒蛋白誘導膠原礦化所發生的機制,Price等[54]再次將胎兒蛋白引入到膠原纖維礦化中,發現在高濃度的磷酸鈣溶液中,晶體的形成由均勻成核驅動,未加入胎兒蛋白的膠原纖維發生了纖維外的礦化;而加入胎兒蛋白之后,膠原纖維外礦物的生長和沉淀被抑制,而膠原內部的礦化不能被抑制,從而使得纖維內礦化效果更好.該過程也稱為“通過抑制劑排除進行礦化”,即排除在纖維外的分子抑制纖維外磷灰石的生長從而觸發膠原纖維內的礦化.

這一理論強調了膠原結構的半透性對纖維內礦化形成的重要作用,為血清誘導的膠原鈣化提供了一個合理的機制.然而,這一理論未提及無定形中間相的存在,不能解釋小磷灰石晶體存在的必要性以及小晶體滲入纖維內空間的驅動力.

3.4 靜電吸引理論

上述三種理論從不同角度解釋了NCPs在膠原礦化中的重要作用,其中膠原被認為是礦物形成的被動支架和模板.但在礦化研究過程中,膠原被證實與磷酸鈣的成核之間存在密切關系[55],亦可作為礦化的催化劑.這一作用主要歸因于膠原纖維上的帶電氨基酸殘基,通過電荷相互作用吸引礦物,誘導礦物滲透到膠原纖維內.

Landis等[9,56,57]認為膠原所帶有的正電荷與負電荷可分別與礦化液中的磷酸鹽離子和鈣離子發生相互作用,隨后富集的離子在孔區附近成核形成HAP晶體.此理論存在的致命缺陷在于未體現NCPs及其類似物的作用,而事實上實現纖維內礦化的條件之一是NCPs及其類似物所起到的穩定誘導作用,與事實背離導致上述觀點未得到普遍認可.

Nudelman等[55,58,59]亦贊同膠原與前驅體之間的相互作用對礦化具有非常重要的意義.但與上述理論不同之處在于:該研究者們將膠原纖維的周期性區域劃分為了abcde 5類條帶,其中a和c帶呈正電性,可靜電吸引前驅體溶液中負電性物質進入膠原纖維內實現礦化.例如,PAsp穩定的ACP前驅體溶液會特定地進入膠原纖維孔區中C端a帶形成礦化(如圖8所示).主要原因在于膠原纖維孔區中C端a帶呈正電的氨基酸簇與帶負電荷的PAsp-ACP礦物復合物發生了相互吸引作用,在誘導ACP進入纖維過程中起著關鍵作用,從而實現膠原纖維內的礦化[56].此理論較好地解釋了礦化發生位點具有特異性的事實,且與NCPs及其衍生物帶負電荷的特性相符合.然而,卻無法解釋為什么同樣呈正電性的c帶未發生明顯的礦化現象.

圖8 醋酸鈾染色非礦化與礦化24 h膠原纖維的TEM圖[58]

在2020年,Wang等[60]制備了一種新型誘導劑——兩性寡肽并研究了膠原的礦化過程.雖然其結果支持了靜電吸引理論,但同時提出了新的礦化過程(如圖9所示):(1)寡肽自組裝成絲狀結構并通過靜電與氫鍵作用結合在膠原纖維表面; (2)寡肽中帶有負電的Glu等氨基酸殘基因在靜電作用下自發吸引礦化液中的Ca2+,磷酸鈣前驅體形成不同形狀的無定形前體; (3)無定形前體在纖維內形成平行于纖維長軸排列的HAP晶體,實現膠原纖維內礦化.該理論進一步擴充了靜電吸引理論的內涵.

圖9 兩性寡肽誘導礦化的機制示意圖[60]

3.5 吉布斯塘南(Gibbs-Donnan)平衡理論

前期研究中,為了模擬天然骨的仿生過程,一般選用帶羧基的聚陰離子物質作為誘導劑,認為帶負電的NCPs類似物可以穩定鈣磷溶液,并與膠原相結合誘導礦化.但在后續研究中發現陽離子NCPs類似物也可以穩定鈣磷溶液并誘導礦化.Niu等[61]使用兩種誘導劑(PAH與PAsp)分別在膠原表面引入正、負電荷,使其在具有正電性的PAH-ACP前體中礦化,發現引入正電荷的膠原礦化效果更好,排除了膠原與聚電解質穩定的液體前驅體間只存在短程靜電相互作用的觀點.基于此,作者提出了基于電荷和滲透壓雙平衡的Gibbs-Donnan平衡理論.膠原纖維自身具有半透膜性質,礦化過程中PAH因分子量過大而被排斥在纖維外,但由于其本身的陽離子特性會吸引纖維外的負離子而排斥正離子;為維持纖維內外的電荷平衡,礦化液中的正離子分布發生改變.陽離子如Ca2+、Na+移出纖維;為滿足電勢平衡,Cl-等陰離子亦會移出纖維.纖維外界離子濃度過大,滲透壓使得纖維內部的水分流出、膠原收縮,液態礦化前體被吸引進入膠原內部,并在膠原內部形成彈性回縮力,在氨基酸殘基的作用下從無定形轉化為結晶態的磷灰石,實現纖維內礦化.

Gibbs-Donnan平衡的建立表明了膠原纖維的礦化是由電荷分布驅動的靜電力以及纖維內外腔室間滲透壓驅動的遠程滲透共同的作用,首次揭示了滲透力在膠原礦化中的關鍵作用,為ACP浸潤膠原纖維的驅動力提供了重要的見解.此外,這一新理論提示了在骨組織生物礦化的研究中不應該局限于酸性NCPs,大量的堿性蛋白甚至是廣泛存在的蛋白聚糖都有可能影響著生物礦化的進程.但在這些研究中只使用了部分體外模型和分子模擬,還未有直接的實驗來支持這些理論.

綜上所述,膠原纖維的礦化機制與膠原纖維結構、誘導劑的結構與性質密切相關.PILP理論清楚地總結了膠原的礦化過程,并解釋了聚陰離子誘導劑對礦化液的抑制作用以及誘導劑-礦化液無定形中間相存在的事實,是目前最普遍使用的一種礦化理論.尺寸排阻理論的提出是基于分子量較大的誘導劑無法進入膠原纖維內部但可促使纖維內礦化的事實,但此理論不涉及無定形中間相且無法對小晶體進入纖維內空間的動力進行解釋,存在一定爭議性.靜電吸引理論完善了膠原、聚陰離子以及礦化前驅體之間的作用,解釋了礦化發生位點具有特異性的事實.吉布斯塘南平衡理論綜合考慮了膠原的半透膜性及兩性、誘導劑的分子量以及帶電情況,是目前考慮因素較為全面的理論;該理論引入電荷和滲透壓雙平衡作用的理念,綜合解釋了多種因素在膠原礦化過程中的作用,但目前為止仍需要大量的實驗來進行驗證.

雖然以上機制理論均具有一定的代表性,但存在爭議或論證不足等問題.迄今為止,仍未有理論能夠從膠原纖維、礦化液和誘導劑之間的相互作用等方面完美詮釋膠原礦化機制.因此膠原的礦化機制仍需不斷完善、更新.

4 結論與展望

天然骨是自然界中的有機-無機納米復合材料,礦化膠原纖維很大程度上賦予了其優良的力學性能和良好的生物相容性.為了更好地了解膠原生物礦化,并為礦化膠原基材料的設計提供見解,本文綜述了目前礦化膠原材料的制備和膠原礦化機制及調控因素.

在礦化膠原材料的制備中,除了自體骨本身的羥基磷灰石礦物外,不斷實現礦物的多元化以賦予其更多優良的性能.除此之外,若將礦化膠原與生物活性物質復合,可有效增強其骨誘導性能,例如天然骨材料、人工骨材料、細胞及血漿、生物因子及藥物、多種生物活性物質等.但如何提高其成骨誘導活性,修復大面積復雜骨缺損,同時使其降解速率與成骨速度更加協調平衡需要進一步明確.目前來看,膠原纖維的礦化機制存在很多種可能性,對現有的機制進行補充完善或者提出新的礦化機制是未來發展的趨勢.