紅樹莓CPP 轉錄因子家族的生物信息學及表達分析

鄭奕宸，李 明，李 闖，吳菁菁，李 寒，顧玉紅

（1.河北農業大學 生命科學學院，河北 保定 071001；2.河北農業大學 林學院，河北 保定 071001）

紅樹莓（Rubus idaeusL.）又名覆盆子、懸鉤子、托盤等，屬于薔薇科懸鉤子屬，在寒帶和溫帶各地均有分布［1］。成熟果實為聚合性小漿果，是同時含有營養和保健功能的第3 代新興水果之一，有“世界水果之王”的稱號，具有很高的商業價值［2］。其果實成熟時不僅具有誘人的紅色，獨特的風味，且富含鞣花酸、水楊酸、花青素和氨基酸等營養物質，鞣花酸、水楊酸和花青素等酚類物質具有抗氧化、抗炎的作用［3］，并且具有抑制阿爾茨海默病進展的潛力［4］，氨基酸對腸道微生物健康具有重要作用［5］；有研究從樹莓果肉中分離出的新型酸性多糖（RPP-3a）具有免疫刺激和抗氧化活性，是一種有益健康的功能性膳食補充劑［6］。

CPP（Cysteine-rich Polycomb-like Protein）或TCX（tesmin/TSO1-like CXC protrin）轉錄因子，是一類成員較少的轉錄因子家族，在動植物中均有分布，但在酵母和原核生物中未檢測到［7］。轉錄因子作為生物體內與基因特異性結合并調節翻譯程序的蛋白質，參與代謝調節［8］、環境脅迫適應［9-10］以及生長發育［11］等多種生命活動，是了解生命活動作用的關鍵因子。CPP 家族的典型結構是一個富含半胱氨酸的CRC 結構域，是由2 個高度保守的CXC 結構域和之間的R 結構構成的，可與其它基因啟動子區域相互作用調控表達或抑制目的基因［12］。已有研究表明，擬南芥CPP 基因家族的TSO1基因作為細胞分裂調節因子在花分生組織中發揮作用［13］；番茄果實中的SlCPP4通過直接調控RIN和LAA9基因的表達調控番茄果實成熟過程［14］；玉米中的ZmCPP基因在冷、熱、干旱和鹽脅迫反應條件下均有差異表達，參與了玉米多種脅迫的生理過程［15］；橡膠樹葉片中HbCPP1基因受到外源ABA處理后表達量顯著上調，積極響應ABA 的誘導，參與調節植物的生長發育［16］。這些結果表明，CPP轉錄因子在調節植物生長發育以及響應脅迫過程中具有重要作用。除此之外，前人在大麥［17］、大豆［18］、茶樹［19］和陸地棉［20］等多種物種中對CPP 轉錄因子完成了鑒定與分析，而紅樹莓中還沒有關于CPP轉錄因子的報道。

本研究通過生物信息學分析方法對‘海爾特茲’紅樹莓轉錄組數據庫中得到的CPP 轉錄因子家族的基本信息進行分析，使用在線軟件對其理化性質、磷酸化位點、信號肽、亞細胞定位、跨膜結構、二級結構、三級結構、基因結構、保守基序、系統進化樹、啟動子順式作用元件、表達量進行分析，進一步利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術研究CPP轉錄因子家族在果實發育過程中表達量的變化，旨在闡明紅樹莓CPP 轉錄因子家族的生物信息學信息及其在果實不同發育時期中表達的變化規律，并結合兩者信息以期為RuCPPs基因功能的研究提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料紅樹莓品種為‘海爾特茲’，以青果（花后15 d）、黃果（花后25 d）、紅果（花后28 d）、深紅果（花后30 d）4 個發育時期的紅樹莓果實為材料，將果實采集后，用液氮速凍后-80 ℃冰箱凍存備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA 的提取和轉錄組測序 使用多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒提取紅樹莓果實中的RNA，每個發育時期的紅樹莓果實均進行3 次重復。將提取的RNA 樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行轉錄組測序，測序結果上傳至上海美吉生物云平臺（https://cloud.majorbio.com/）進行后續數據分析。

1.2.2 紅樹莓CPP 基因家族生物信息學分析 在美吉生物云平臺（https://cloud.majorbio.com/）轉錄組數據中鑒定出4 個CPP 轉錄因子家族成員，將其依次命名為RuCPP-1、RuCPP-2、RuCPP-3、RuCPP-4，并下載蛋白質序列等相關信息。分別利用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）、ExPASy–ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）、NetPhos 3.1 Serve（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）、SignalP 5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、Cell Ploc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）、TMHMM 2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）、SMART（http://smart.emblheidelberg.de/）、和SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）、SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）分析‘海爾特茲’紅樹莓中CPP 轉錄因子家族4 個成員的理化性質、親疏水性、磷酸化位點預測、信號肽預測、亞細胞定位、跨膜結構預測、保守結構域、二級結構、三級結構。

1.2.3 紅樹莓CPP 基因家族成員的系統進化分析 利用轉錄組數據庫下載‘海爾特茲’紅樹莓CPP 轉錄因子家族的蛋白質序列，從plantTFDB 網站上獲取擬南芥、野生稻CPP 蛋白序列。通過MEGA11 軟件，使用鄰接法（Neighbor-Joining），進行1 000 次重復，分別將4 個RuCPP 蛋白序列與擬南芥和水稻CPP 蛋白序列構建系統發育樹，再利用ITOL（https://itol.embl.de/）在線網站對進化樹進行美化。

1.2.4 紅樹莓CPP 基因家族成員基因結構及蛋白保守基序分析 利用轉錄組數據庫下載‘海爾特茲’紅樹莓CPP 轉錄因子家族的CDS 序列和基因序列，利用GSDS 在線分析RuCPPs基因結構；利用MEME 網站導出RuCPPs基因保守基序文件，設置保守基序為10 個，并通過TBtools 軟件生成圖片。

1.2.5 紅樹莓CPP 基因家族成員的啟動子順式作用元件分析 利用NCBI 網站查找RuCPPs基因長度為2 000 bp 的啟動子序列，利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測RuCPPs 基因家族成員的啟動子順式作用元件。

1.2.6 紅樹莓CPP 基因家族成員在果實發育過程中的表達分析 轉錄表達分析是以‘海爾特茲’4 個發育時期果實的轉錄組測序FPKM（Fragments Per Kilobase per Million）值作為基因表達量進行表達分析并在美吉云平臺制作熱圖。

qRT-PCR 表達分析是先提取樹莓果實4 個發育時期青果、黃果、紅果和深紅果的RNA，使用反轉錄試劑盒合成cDNA。以GAPDH基因作為內參，設計CPP 家族基因的特異性引物進行qRT-PCR 分析（表 1），使用Premier 軟件設計特異性引物，由生物工程股份有限公司合成。每個樣品進行3 次重復。PCR 反應體系為：水9.5 μL，模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，2×M5 HiPer SYBR PremixEsTaq12.5 μL。實時熒光定量PCR 程序：96 °C 預變性30 s；95 °C 5 s，60 °C 30 s，39 個循環。利用2-ΔΔCT法對基因相對表達量進行計算。

表1 RuCPP 和GAPDH 的引物序列Table 1 Primer sequences of RuCPP and GAPDH

2 結果與分析

2.1 紅樹莓CPP 基因家族生物信息學分析

由表2 可知，RuCPPs 編碼的蛋白質氨基酸數量在433～793 個之間，相對分子質量在47 175.57～86 763.46 kD 之間，等電點在5.83～9.20之間。RuCPPs 的不穩定系數大于40，為不穩定存在的蛋白質。親水性平均系數均小于0，均為親水性蛋白質。磷酸化位點預測結果顯示，RuCPP-4 基因的磷酸化位點最多，為110 個，RuCPP-1 的磷酸化位點最少，為39 個，4 個成員中含有磷酸化位點最多的氨基酸均為絲氨酸，其次為蘇氨酸，最少的為酪氨酸。信號肽預測顯示4 個成員均無信號肽，說明為非分泌蛋白質。亞細胞定位預測發現4 個成員均定位于細胞核?？缒そY構預測顯示4 個成員均無跨膜結構。保守結構域預測顯示，RuCPPs 均在不同位置含有2 個CXC 保守結構域，推測CXC 為CPP 蛋白中央結合DNA 保守結構域。

表2 紅樹莓CPP 基因家族成員編碼蛋白質的理化性質Table 2 Physico chemical properties of CPP proteins in red raspberry

由表3 可知，二級結構預測結果顯示RuCPPs編碼的蛋白質均由α 螺旋、β 轉角、無規則卷曲、折疊延伸鏈共4 種結構構成，RuCPP-1、RuCPP-2、RuCPP-3、RuCPP-4 占比大小排序均為無規則卷曲＞α 螺旋＞折疊延伸鏈＞β 轉角，即無規則卷曲占比最大，使蛋白質更卷曲折疊，α 螺旋占比次之，推測其蛋白空間結構比較??；三級結構預測結果與二級結構一致，可信度較高。

表3 紅樹莓CPP 基因家族編碼蛋白質的二、三級結構分布信息Table3 Distribution information of secondary and tertiary structures of CPP proteins in red raspberry

2.2 紅樹莓CPP 基因家族成員基因結構及蛋白保守基序分析

利用GSDS 在線網站制作RuCPPs 基因家族成員的基因結構，如圖1 所示；利用TBtools 軟件結合各成員進化關系、保守基序和基因結構，如圖2所示?？梢钥吹絉uCPPs 基因含有8～12 個外顯子，7～11 個內含子；RuCPPs 含有7～8 個保守基序motif，4 個基因均含有motif1、motif2、motif3、motif4 和motif7，推測這5 個保守基序為RuCPPs發揮作用的功能結構域；RuCPP-1、RuCPP-2、RuCPP-3、RuCPP-4 基因分別含有8、8、11 和10段CDS 序列，為之后編碼蛋白質做準備。

圖1 紅樹莓CPP 基因家族編碼蛋白質的外顯子結構Fig. 1 Exon structure of CPP genes in red raspberry

2.3 紅樹莓CPP 基因家族成員的系統進化分析

紅樹莓的4 個CPP 基因與擬南芥的7 個CPP基 因、野生稻 的18 個CPP 基因共29 個CPP 基因共同制作系統發育樹，如圖3 所示，可以看到分為4 個不同分組，RuCPP-1 和RuCPP-3 基因共為一個分組，親緣關系較近，并且與擬南芥（Arabidopsis halleri，Araha.8902s0003.1.p）和（Araha.0305s0002.1.p）聚 為1 類；RuCPP-2 基因與野生稻(Oryza barthii)(OBART04G02690.1)、擬南芥（A.halleri，Araha.28677s00001.1.p）聚為1 類；RuCPP-4 基因與 擬南芥（A.halleri，Araha.1020s0004.1.p）和（Araha.34278s00001.1.p）聚為1 類。綜上所述，說明RuCPPs 家族基因與擬南芥的CPP 基因親緣關系較近，并且可能與上述基因具有相似的生物學功能。

圖3 紅樹莓4 個CPP 基因的系統進化分析Fig. 3 Systematic evolution analysis of four CPP genes in red raspberry

2.4 紅樹莓CPP 基因家族成員的啟動子順式作用元件分析

在RuCPPs 基因轉錄調控區域含有的能與特異轉錄因子結合進而影響轉錄水平的一端DNA 序列，可以直接調控基因表達，所以研究其作用元件極為重要。由圖4 可知，RuCPPs 基因的啟動子順式作用元件包含參與光反應的元件或元件的一部分：RuCPP-1 和RuCPP-3 的GT1-motif、RuCPP-2的3-AF1 binding site、RuCPP-4 的TCT-motif、RuCPP-1 的MYBHv1 結合位 點、RuCPP-1 的CCAAT-box；參與黃酮類生物合成基因調控的MYB 結合點：RuCPP-4 的MBSI；參與脫落酸反應性的順式作用元件：RuCPP-1、RuCPP-2、RuCPP-3 和RuCPP-4 的ABRE；參與防 御和應激反應的順式作用元件：RuCPP-4 的TC-rich repeats；厭氧誘導和缺氧特異性誘導所必需的順式作用調節元件：RuCPP-1、RuCPP-2、RuCPP-3和RuCPP-4 的ARE；參與低溫反應性的順式作用元件：RuCPP-3 的LTR；參與生長素反應性的元件：RuCPP-2 和RuCPP-3 的TGA-element；參與赤霉素反應性的元件：RuCPP-2 的GARE-motif、RuCPP-4 的P-box；參與干旱誘導的MYB 結合點：RuCPP-2 的MBS；參與光反應的MYB 結合位點：RuCPP-1 的MRE；參與胚乳表達的順式調控元件：RuCPP-3 和RuCPP-4 的GCN4-motif；與分生組織表達有關的順式調節元件：RuCPP-2 和RuCPP-3的CAT-box；參與水楊酸反應性的順式作用元件：RuCPP-2 的TCA-element；參與MeJA 反應的順式作用調控元件：RuCPP-2、RuCPP-3 和RuCPP-4的CGTCA-motif。以上結果表明RuCPPs 基因在調節植物激素、抵抗外界機械傷害、響應光反應、干旱誘導、缺氧誘導、胚乳和分生組織表達以及調節植物生長發育過程中發揮重要作用。

圖4 紅樹莓4 個CPP 基因的啟動子順式作用元件Fig. 4 Cis-acting elements on the promoters of four CPP genes of red raspberry

2.5 紅樹莓CPP 基因家族成員在果實發育過程中的表達分析

轉錄組表達量結果如圖5 所示。

圖5 紅樹莓4 個CPP 基因在果實發育時期的轉錄組的表達量Fig. 5 Transcriptome analysis of four CPP genes in red raspberry during fruit development

紅樹莓果實從青果發育到深紅果的過程中，RuCPP-1 基因的表達量呈下降趨勢，青果時期的表達量最高；RuCPP-2 基因的表達量整體呈先上升再下降趨勢，紅果時期表達量最高；RuCPP-3 基因的表達量整體呈上升趨勢，深紅果時期表達量最高；RuCPP-4 基因的表達量整體呈下降趨勢，青果時期的表達量最高。

qRT-PCR 試驗表達量結果如圖6 所示，RuCPP不同基因在果實發育不同時期均有不同程度的表達，且與轉錄表達趨勢一致，均表明該基因家族可能參與果實的發育過程。以青果時期的表達量作為對比，除RuCPP-2 基因在紅果時期以及RuCPP-3 基因在深紅果時期的相對表達量較高之外，其余時期中的相對表達量均低于青果時期。

圖6 紅樹莓4 個CPP 基因在果實發育時期的qRT-PCR表達量Fig. 6 Expression of four CPP genes detected by qRT-PCR during fruit development of red raspberry

3 討論與結論

3.1 CPP 基因家族成員的生物信息學分析

CPP 轉錄因子家族是存在于多種植物中的轉錄因子，在杧果［21］、大豆［18］、茶樹［22］的3 個品種‘Yunkang10’‘Biyun’和‘Shunchazao’中分別被鑒定出10、20、7、8 和8 個成員。本研究從‘海爾特茲’紅樹莓轉錄組數據庫中得到4 個CPP家族成員，并通過生物信息學分析與轉錄組表達量結合研究鑒定其功能，增加了CPP 轉錄因子的植物種類。本研究中理化性質分析說明RuCPPs 均為親水性蛋白質，與茶樹［22］中預測CsCPP 為親水性蛋白質結果一致；亞細胞定位預測結果為RuCPP-1、RuCPP-2 和RuCPP-4 定位在細胞核中，RuCPP-3定位在細胞核或細胞膜中，與小麥［23］的試驗驗證結果大多定位于細胞核中類似；CPP基因的典型結構域就是由R 基序分離的2 個高度保守的CXC 結構域［24］，本研究的結果同樣為這一觀點進行補充驗證，但不同基因的保守結構域位置不同，這種不同可能是基因行使不同功能的原因；對RuCPPs進行基因結構、系統進化樹和啟動子順式作用元件分析，結果顯示處于進化關系較近的RuCPP-1 和RuCPP-3 的基因結構類似；并且紅樹莓與雙子葉植物擬南芥的進化關系較近，與單子葉植物野生稻的進化關系較遠，這種結果與擬南芥、粳稻和玉米［25］的進化關系一致，表明CPP基因隨著被子植物中單子葉植物和雙子葉植物的演化進行分化。

3.2 CPP 基因家族成員的表達分析

RuCPPs基因啟動子順式作用元件結果與其它植物結果類似，大麥HvCPP［17］中含有大量ABA、GA 激素響應元件、黃瓜CsCPP［26］中含有大量與脅迫相關的順式作用元件，RuCPPs基因顯示含有調節植物激素、抵抗外界機械傷害、響應光反應、干旱誘導、缺氧誘導、胚乳和分生組織表達以及調節植物生長發育的元件，表明RuCPPs基因可能在激素信號傳導和抵抗逆境脅迫中起重要作用；RuCPPs基因在果實發育過程中的轉錄組的表達量和qRTPCR 表達量變化均發現，不同基因在果實不同時期的表達量不同，RuCPP-1 和RuCPP-4 基因在青果時期的表達量最高，RuCPP-2 和RuCPP-3 基因分別在紅果和深紅果時期的表達量最高，而RuCPPs基因均含有與脫落酸相關的順式作用元件，所以推測RuCPP-1 和RuCPP-4 基因參與脫落酸的負調控反應，RuCPP-2 和RuCPP-3 基因參與脫落酸的正調控反應，具體反應機制還需要進一步研究。

綜上所述，本研究通過結合RuCPP 轉錄因子家族的生物信息學分析和表達分析結果，為進一步探索CPP 轉錄因子家族在紅樹莓果實中的功能提供基礎。