牦牛源地衣芽孢桿菌的分離鑒定

王冬經

（西藏自治區農牧科學院畜牧獸醫研究所/省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室，西藏 拉薩 850000）

芽孢桿菌屬（Bacillus）是一類需氧或兼性厭氧異養細菌，革蘭氏染色呈陽性，菌體呈直桿狀，長度約1.2～10 μm，寬度約0.5～2.5 μm，成對或鏈狀排列，周生鞭毛［1］，芽孢桿菌在自然界中分布廣泛，比如土壤、水源、下水道中均有分布，不良生長環境下可產生芽孢，故名芽孢桿菌［2-4］。芽孢桿菌種類復雜多樣，主要包括地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）、凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）以及致病性的肉毒梭狀芽孢桿菌（Clostridium botulinum）、破傷風芽孢桿菌（Clostridium tetani）、炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）等［5］。其中，地衣芽孢桿菌在農業、醫藥行業及食品工業等領域都被廣泛地應用［6］。地衣芽孢桿菌在惡劣條件下可形成芽孢的特性，能夠抵御極端環境，具有極強的生存能力，在制劑、存儲和運輸過程中不易死亡［7］，從而成為工業生產菌株較理想的選擇，具有廣闊的應用前景。

牦牛主要棲息在青藏高原及周圍地區，是青藏高原的優勢畜種，也是當地牧民重要的生產生活資料［8］。由于青藏高原獨特的地理環境，牧草產量和營養水平遠不能滿足牦牛正常的營養需要，冬季最為嚴重，導致牦牛出欄周期長、養殖效益低等問題［9］。瘤胃是牦牛消化飼糧的重要場所，其中含有大量的細菌、真菌、原生蟲和古生菌等［10］，瘤胃發酵及菌群結構組成對其生產性能具有重要影響和意義。研究表明，不同海拔環境放牧牦牛的腸道菌群組成具有明顯的差異，并且腸道菌群對于牦牛適應高海拔生境具有重要功能［11］。本研究擬從牦牛糞便中分離地衣芽孢桿菌，并進行生化特性、分子生物學鑒定，為今后開發研制針對我區牦牛促生長、抗菌、促消化、調節腸道菌群等方面的益生菌和微生態制劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備

隔水式電熱恒溫培養箱、搖床、顯微鏡、PCR儀、電泳儀、立式壓力蒸汽滅菌鍋、凝膠成像、隔水式電熱恒溫培養箱、離心機、生物安全柜、電熱鼓風干燥箱、低溫保存箱、電子天平、凈水器等均來自省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室。

1.2 主要試劑

培養基胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養基（TSB）來自于青島海博生物技術有限公司；革蘭氏染色試劑來自于珠海貝索生物技術有限公司；Trans2K Plus DNA Ladder 來自于天根生化科技有限公司；藥敏紙片來自于杭州微生物試劑有限公司；微量生化反應管來自于青島海博生物技術有限公司；2XTaq PCR MasterMix 來自于上海生工。

試驗所用細菌16S rRNA 通用引物干粉來自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 試驗材料

2022 年12 月，從西藏各地采集牦牛糞便17份，運送回實驗室后低溫保存，待用。

1.4 分離培養與染色鏡檢

用滅菌槍頭挑取適量牦牛糞便接種于TSB培養基，37 ℃培養18 h，劃線接種到固體培養基，得到單克隆菌落后，再次接種至液體培養基增菌，保存。同時取少量菌液進行革蘭氏染色和鏡檢觀察，拍照記錄。

1.5 生化鑒定

嚴格按照微量生化鑒定管說明書進行操作。

1.6 分子生物學鑒定

挑取單個菌落，提取細菌基因組，利用細菌16S rRNA 通用引物，進行PCR 擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物片段大小。將擴增產物送至公司測序、對比分析，通過DNA Star 軟件構建系統進化樹，其中參考菌株信息如表1所示。

表1 16S rRNA參考菌株

1.7 藥物敏感性試驗

試驗采用紙片擴散法（Kirly-Baue 法），選取青霉素、氨芐西林、林可霉素、頭孢曲松、四環素、紅霉素、恩諾沙星、氯霉素、環丙沙星、阿莫西林10 種抗菌藥進行藥物敏感性試驗，嚴格按照藥敏片說明書進行試驗操作及結果判定。

2 結果

2.1 分離純化與形態觀察

從17 份糞便中，得到了3 株細菌，對分離株進行革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陽性桿菌，呈桿狀，藍紫色、有芽孢。初步判定分離株為芽孢桿菌，并命名為XZ-1，XZ-2，XZ-3。

2.2 生化鑒定

生化鑒定結果如表2 所示，3 株分離株生化檢測結果一致：可分解甘露醇、淀粉、阿拉伯糖，可還原硝酸鹽，V-P 試驗呈陽性，不能水解明膠，不能產生紅色吲哚。

表2 分離株生化鑒定結果

2.3 16S rRNA PCR鑒定結果

分離株16S rRNA PCR 擴增產物電泳結果與預期結果一致，長度為1 500 bp左右（圖1）。

圖1 分離菌株16S rRNA基因PCR擴增結果

2.4 序列分析

由表3 可知，3 株分離株之間的同源性為96.0%～99.9%，與地衣芽孢桿菌分離株的同源性為98.3%～100.0%；其中分離株XZ-1 與地衣芽孢桿菌分離株的同源性為100.0%，與蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus分離株ATCC14579 的同源性為93.6%，與短小芽孢桿菌Bacillus pumilus分離株Y24 的同源性為95.9%，與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis分離株HSY21 的同源性為98.0%，與解淀粉酶芽孢桿菌Bacillus velezensis分離株IMB16-090 的同源性為97.9%；分離株XZ-2 與地衣芽孢桿菌分離株的同源性為99.9%，與蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus分離株ATCC14579 的同源性為93.7%，與短小芽孢桿菌Bacillus pumilus分離株Y24 的同源性為96.0%，與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis分離株HSY21的同源性為98.2%，與解淀粉酶芽孢桿菌Bacillus velezensis分離株IMB16-090 的同源性為98.0%；分離株XZ-3 與地衣芽孢桿菌分離株的同源性為98.3%，與蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus分離株ATCC14579 的同源性為94.8%，與短小芽孢桿菌Bacillus pumilus分離株Y24 的同源性為96.6%，與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis分離株HSY21的同源性為98.4%，與解淀粉酶芽孢桿菌Bacillus velezensis分離株IMB16-090的同源性為97.6%。

由16S rRNA 核酸序列進化樹如圖2 所示，3 株分離株與地衣芽孢桿菌處于同一支，而與鏈球菌其他種屬芽孢桿菌處于不同分支。

圖2 基因進化樹

2.5 藥物敏感性試驗

藥物敏感性試驗結果如表4 所示，分離株XZ-1 對青霉素、氨芐西林耐藥，對林可霉素中度敏感，對頭孢曲松、四環素、紅霉素、恩諾沙星、氯霉素、環丙沙星、阿莫西林敏感；分離株XZ-2 對青霉素、氨芐西林、四環素、林可霉素耐藥，對氯霉素中度敏感，對頭孢曲松、紅霉素、恩諾沙星、環丙沙星、阿莫西林敏感；分離株XZ-3 對青霉素耐藥，對氨芐西林、對林可霉素中度敏感，對頭孢曲松、四環素、紅霉素、恩諾沙星、氯霉素、環丙沙星、阿莫西林敏感。

表4 藥物敏感性試驗結果

3 討論

地衣芽孢桿菌是一種常見的革蘭氏陽性細菌，在土壤和鳥類羽毛中分布最多，目前主要用于在農業和工業領域的生產和研究［12-13］。地衣芽孢桿菌具有高分泌堿性絲氨酸蛋白酶的特性，是工業酶生產中最重要的細菌之一［14］。地衣芽孢桿菌還可以生產多肽抗生素，如桿菌肽，可代替抗生素添加在動物飼料中［15］。在農業領域，利用地衣芽孢桿菌的抗真菌活性，能夠有效地抑制植物的煙草黑脛病等真菌性病害［16］。此外，地衣芽孢桿菌可以降解羽毛，從而生產營養豐富的羽毛飼料，飼喂家畜［13］。Yu 等［17］的研究表明，地衣芽孢桿菌在預防肉雞球蟲病方面有一定作用，且可以提高肉雞在柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella）感染下的存活率。地衣芽孢桿菌是一種具有良好拮抗作用的益生菌，已被證實有良好的益生作用，是公認的“安全益生菌”，已被廣泛應用于多種動物的養殖中，如對肉雞的健康有良好的促進作用［18-20］。研究表明，在水中增加地衣芽孢桿菌可以提高雞的吸收消化能力［21］，提高雞的生長性能［22］，并可以減輕壞死性腸炎對雞生長性能的影響并降低死亡率［23］。孫錚［24］的研究表明，地衣芽孢桿菌具有良好的耐受性，能增加小鼠腸道菌群的多樣性和腸道乳桿菌的豐度，這些特征使其具有益生菌開發的潛力。

地衣芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬中具有較強應用潛力的菌種之一，受到國內外各方面的關注日益增多［5］。促生長類藥物飼料添加劑的禁用促使益生菌產業快速發展，而我國商品化的益生菌種類還很少，地衣芽孢桿菌可以產生芽孢，芽孢對熱、酸堿度及其他環境因素的抗性，因此具有巨大的應用潛力［24］。本研究從西藏牦牛糞便中成功分離得到3株地衣芽孢桿菌，并進行生化鑒定、分子生物學鑒定，研究其耐藥性，為今后開展針對我區牦牛疫病防控、益生菌開發、飼料添加劑研制等相關研究提供參考。