狐臭柴葉水提取液延緩秀麗隱桿線蟲衰老作用的研究

潘旭芳,周大寨,朱玉昌*

(1.硒食品營養與健康智能技術湖北省工程研究中心,湖北 恩施 445000;2.湖北民族大學 生物與食品工程學院,湖北 恩施 445000;3.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室,湖北 恩施 445000)

衰老是一種自發的生物過程,在機體的生命中是不可避免的。衰老的過程往往伴隨著身體機能的下降,即身體的生理完整性下降,導致身體器官功能性損傷或死亡等風險增加[1]。一些疾病因素也能引發這種身體機能的漸進性喪失[2],如心血管疾病、糖尿病、神經性退行性疾病、帕金森病等。盡管這種衰老的生物過程是不可逆的,但可通過攝入一些活性物質來延緩衰老。大量研究表明水提取物、醇提取物等活性物質具有延緩秀麗隱桿線蟲壽命的作用[3-5]。尋找延長壽命的化合物或藥物成為了當代科研人員研究的熱點。

秀麗隱桿線蟲作為模式生物模型,以大腸埃希氏菌為食物,按生長時期分為3個時期,胚胎期(L1)、幼蟲期(L2、L3、L4)和成蟲期,其已被廣泛用于抗衰老相關疾病的研究[6-7]。秀麗隱桿線蟲具有生命周期短(易于在實驗室大量培養)、身體透明(便于實驗觀察)、繁殖能力強、全基因組和遺傳背景清晰、對外界環境敏感等優點,使其更適合延緩衰老方面的研究。呂晨豪等[8]研究發現陳皮水提取物可以延長秀麗隱桿線蟲壽命。楊帆等[9]發現益智仁提取物可以通過提高抗氧化酶活力和抗氧化基因的表達水平,延緩線蟲衰老。王軼菲等[10]發現山楂提取物可以有效延緩秀麗隱桿線蟲衰老。目前秀麗隱桿線蟲作為模式生物在水提取物[4]、醇提取物[11]、多糖[12]、毒性物質評估[13]等方面均有研究。

狐臭柴(PremnapuberulaPamp.),別名長柄臭黃荊、豆腐柴、臭黃荊、臭樹、斑鳩占等,屬馬鞭草科豆腐柴屬植物[14-15],在我國廣泛分布于華東、中南、華南及西南等地,是一種藥食兼用的植物。湖北、湖南等地常用其葉制作涼粉食用,名曰“神仙豆腐”。其功能性成分主要包括黃酮類、多酚類及多糖類等[16],具有降暑消炎、抗氧化、降血糖等[17]藥理活性。其葉的水提液中主要含有多糖、黃酮、多酚及氨基酸類物質,具有顯著的抗炎、抑菌以及抗氧化效果。Li等[18]發現豆腐柴果膠具有抗氧化和抗炎作用。Song等[19]發現豆腐柴多糖可以通過增強宿主的腸道抵抗力來改善炎癥。李爽等[20]發現狐臭柴揮發油具有較強的抗氧化、抗菌和抗腫瘤活性。而狐臭柴葉片功能性成分的研究主要集中在果膠、蛋白質、多酚及黃酮類化合物的提取與抗氧化活性研究,對狐臭柴葉水提取液(PremnapuberulaPamp.leaves water extract,PPW)抗衰老活性方面的研究鮮有報道。

以模式生物秀麗隱桿線蟲作為研究對象,測定狐臭柴葉水提取液對線蟲壽命、蟲體長度、運動能力、紫外應激能力以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的影響,進而以苯酚-硫酸法、酒石酸鐵法、硝酸鈉-硝酸鋁法及考馬斯亮藍法分別測定PPW中多糖、總黃酮、總酚、蛋白質的含量,對延緩線蟲衰老機制做了初步研究。以期探究PPW延緩秀麗隱桿線蟲衰老的作用,為狐臭柴資源的綜合開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

狐臭柴鮮葉于2022年8月采摘于湖北省利川市湖北雄展農業開發有限公司種植基地,經湖北民族大學易詠梅教授鑒定為狐臭柴(PremnapuberulaPamp.)的葉片。鮮葉洗凈后于55℃烘干,超微粉碎過60目篩,密封后于4℃保存備用。

N2野生型秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)、大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)OP50由湖北民族大學方慶老師惠助;其他試劑有5-氟尿嘧啶(上海麥克林生化科技有限公司,分析純),膽固醇(上海源葉生物有限公司,分析純),瓊脂粉、LB肉湯、胰蛋白胨(北京奧博星生物技術有限責任公司,生物試劑)等。

實驗儀器有生化培養箱(上海新苗醫療器械制造有限公司,SPX-1505H-II)、高速冷凍離心機(湘儀離心機有限公司,H2050R)、超凈工作臺(蘇潔凈化設備有限公司,SJ-CJ-2FDQ)、超微粉碎機(廣州市旭朗機械設備有限公司,XL-30C)、超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,KQ5200E)。

1.2 PPW對秀麗隱桿線蟲抗衰老活性的測定

1.2.1 線蟲培養及同期化 線蟲的培養在線蟲生長固體培養基(nematode growth medium,NGM)上進行,稱量1.0g胰蛋白胨、6.8g瓊脂粉、1.2g NaCl,溶于400mL去離子水中,高溫高壓滅菌20min,冷卻至60℃左右,于超凈工作臺中加入無菌的400μL1mol/L CaCl2、400μL1mol/L MgSO4、400μL 5mg/mL膽固醇和10mL 1mol/L磷酸鉀緩沖液,混勻后倒入培養皿中,每個平板加入100μLE.coliOP50菌液作為線蟲食物,置于20℃生化培養箱中培養。

線蟲同期化參照文獻[21]略有改動,采用裂解法,裂解液為2.5mL無菌水、1.5mL次氯酸鈉和1mL 2mol/L NaOH的混合液。用M9緩沖溶液將大量蟲卵及成蟲期線蟲沖洗至14mL無菌離心管中,以6000r/min轉速離心3min,用M9緩沖溶液沖洗2次,最后留1mL蟲液,加入裂解液后,反復振蕩 10min,中間停留30s左右,待看到沒有明顯蟲體時,離心去除上清液,用M9清洗2次,無菌水清洗1次,最后留1mL蟲液,將其轉到涂有E.coliOP50的NGM培養基上,連續培養72h,即得到同期化的L4期線蟲。

1.2.2 PPW制備及給藥途徑 按狐臭柴粉末與去離子水比例為1∶60(g/mL)在45℃恒溫的磁力攪拌器中水浴提取1h,提取結束后以8000r/min轉速離心10min,得到上清液備用。以上清液為母液,命名為PPW,用E.coliOP50菌液將其稀釋為25%、50%、75%的狐臭柴葉水提取液備用。

給藥途徑:在24孔板的NGM培養基中加入20μL樣品和20μL 5-氟尿嘧啶;在直徑為6cm的培養皿中加入1mL樣品和1mL 5-氟尿嘧啶?？瞻捉M以E.coliOP50菌液為對照,開蓋紫外滅菌2h,待其自然晾干。

1.2.3 線蟲壽命測定 參照文獻[7]略有改動,將L4期的秀麗隱桿線蟲轉移至空白組和含PPW分別為25%、50%、75%的24孔板,從轉移當天開始記為0d,每24h轉移線蟲至對應的實驗組新平皿中,每孔線蟲約30條,共90條線蟲,每天記錄死亡數和存活數,直到線蟲全部死亡。判斷死亡的標準為:無運動及無食物吞咽行為且用挑蟲器拍打蟲體無反應。運用SPSS軟件繪制生存曲線,計算最長壽命(最后10%存活線蟲的平均值)、平均壽命。

1.2.4 線蟲蟲體長度的測定 培養方法同1.2.3節中的線蟲培養步驟,培養4d后收集秀麗隱桿線蟲,用NaN3麻醉之后在顯微鏡下拍照。實驗至少重復3次,每組至少30條。

1.2.5 運動能力的測定 培養方法與1.2.3節中的方法相同,培養4d后收集秀麗隱桿線蟲,轉入加有M9緩沖溶液而不含E.coliOP50菌液的48孔NGM培養基中,每孔1條,每組10條,讓其自由運動1min,觀察線蟲20s內身體彎曲的次數,彎曲標準為秀麗隱桿線蟲往蟲體長軸方向1個波動記為1次身體彎曲。

1.2.6 線蟲抗紫外應激能力的測定 參照文獻[22]略有改動,培養方法同1.2.3節中的方法,培養4d后轉入到空白的NGM培養基,放在超凈工作臺(紫外燈的直徑為19mm、功率為18W,培養基距紫外燈的距離為135cm)。開蓋紫外滅菌,每30min觀察并計數各組線蟲的生存情況,至所有線蟲全部死亡,線蟲死亡評判標準與壽命實驗標準相同。每孔10條,每組至少30條,每次重復3次平行實驗。

1.2.7 線蟲體內MDA含量的測定 MDA為脂膜過氧化程度的指標。在高溫條件下,可以與硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)反應生成紅棕色的三甲川,在532nm處有最大吸光度,運用該原理可測得MDA的含量。將L4期的秀麗隱桿線蟲轉移至空白組和PPW含量為25%、50%、75%的直徑為6 cm的培養皿,每板至少1000條線蟲,培養4d之后收集線蟲,無菌水清洗2次,去掉上清液。加入提取液,用超聲波清洗器破碎蟲體,以8000r/min轉速離心10min,得到上清液待測。根據雙組分分光光度計法,計算MDA的含量,計算公式為

C=[6.45×(A1-A2)-0.56×A3]/Cpr。

其中,C為MDA的含量,單位為μmol/mg;A1、A2、A3分別代表532、450、600nm處的吸光度值;Cpr為線蟲體內蛋白質的質量濃度,單位為mg/mL。

1.3 PPW中主要成分測定

1.3.1 多糖的測定 采用苯酚-硫酸法測定PPW中多糖的含量,以葡萄糖醛酸作為標準品,繪制質量濃度為0.2～1.8mg/mL的標準曲線。反應體系中加入2mL標準品、1mL 9%苯酚、5mL硫酸,暗反應30min,在490nm處測吸光度值。得到標準曲線為y=0.0046x+0.0223,R2=0.9941。按標準曲線制作方式加入狐臭柴葉水提取液,根據標準曲線計算PPW中多糖的含量。

1.3.2 總酚的測定 采用酒石酸鐵法,繪制沒食子酸質量濃度為200～800μg/mL的標準曲線,得到標準曲線為y=0.001x+0.0373,R2=0.9917。按標準曲線制備的方法加入狐臭柴葉水提取液,根據標準曲線計算PPW中總酚的含量。

1.3.3 總黃酮的測定 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁分光光度法,繪制蘆丁標準品質量濃度為50～250μg/mL的標準曲線,得到標準曲線為y=0.0038x+0.0157,R2=0.9959。按標準曲線的制作方法加入狐臭柴葉水提取液,根據標準曲線計算PPW中總酚的含量。

1.3.4 蛋白質的測定 采用考馬斯亮藍法,繪制牛血清蛋白標準品質量濃度為0.02～0.12mg/mL的標準曲線,得到標準曲線為y=7.3357x+0.0363,R2=0.9941。按標準曲線的制作方法加入狐臭柴葉水提取液,根據標準曲線計算水提取液中蛋白質的含量。

1.4 數據處理

運用SPSS 26.0軟件對實驗結果進行單因素方差分析(analysis of variance,ANOVA),采用鄧肯式多重比較對差異顯著性進行比較分析,P<0.05表示差異顯著。運用Origin 2022進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 PPW對線蟲自然壽命的影響

壽命是評價機體是否衰老的最直接體現。PPW對線蟲壽命影響的生存曲線如圖1所示。由圖1可知,與空白組相比,用不同含量的PPW喂養線蟲均可使線蟲的生存曲線右移,延長最長壽命。PPW對線蟲壽命影響的統計分析如表1所示。由表1可知,使用25%、75%的PPW喂養線蟲之后,線蟲的平均壽命在13.08d左右,最長壽命上升至19.00d以上,與空白組相比,其平均壽命有顯著性差異。當喂養PPW含量為50%時,其最長壽命為20.33d,平均壽命為13.47d,與空白組相比平均壽命延長了16.42%。由此可見,狐臭柴葉水提取液可以顯著延緩線蟲的自然壽命。該結果與孫翌等[23]研究豆腐柴提取物在適當濃度下可以延長果蠅壽命相似。

表1 PPW對線蟲壽命影響的統計分析Tab.1 Statistical analysis of effects of PPW on longevity of Caenorhabditis elegans

圖1 PPW對線蟲壽命影響的生存曲線Fig.1 Survival plot of the effect of PPW on the lifespan of Caenorhabditis elegans

2.2 PPW對線蟲蟲體長度的影響

機體的生長狀態可以體現喂養濃度對線蟲生長的影響,PPW對線蟲的體長影響如圖2(a)所示。由圖2(a)可知,不同含量的PPW對線蟲的蟲體長度有增長作用。與對照組相比,當喂養PPW含量為25%時,蟲體長度得到了顯著性上升(P<0.05);當喂養PPW含量為50%、75%時,蟲體長度不再增加,表明PPW對線蟲的蟲體長度沒有濃度依賴性。由此得出,PPW可以促進其生長發育,對線蟲的生長發育沒有毒害作用。

注:不同的字母代表差異顯著,P<0.05。注:不同的字母代表差異顯著,P<0.05。(a) PPW對線蟲蟲體長度的影響 (b) PPW對線蟲身體彎曲頻率的影響圖2 PPW對線蟲的蟲體長度及身體彎曲頻率影響Fig.2 Effects of PPW on body length and bending frequency of Caenorhabditis elegans

2.3 PPW對線蟲運動能力的影響

運動給機體帶來健康的同時也可以延長壽命,陳媛麗[24]發現運動可以通過激活線蟲的自噬行為從而延長秀麗隱桿線蟲的壽命。以線蟲身體的彎曲頻率表示線蟲的運動能力,其頻率越大表明運動能力越強。PPW對線蟲身體彎曲頻率影響如圖2(b)所示。由圖2(b)可知,不同含量的狐臭柴葉水提取液對線蟲的身體彎曲頻率有提高作用。當PPW含量為25%時,與空白組相比,線蟲運動能力有差異但差異沒有顯著性;當PPW含量為50%時,運動能力得到顯著性提升,從空白組的1.01次/s上升到1.18次/s,繼續增加喂養含量,運動能力不再增加。綜上可知,PPW可以顯著提高線蟲的身體彎曲頻率,增強運動能力。

2.4 PPW對線蟲抗紫外應激的影響

紫外應激能力可以反映機體對紫外逆環境的適應能力。PPW對線蟲紫外損傷的生存曲線如圖3所示。由圖3可知,對喂養之后的線蟲進行紫外損傷測定,與空白組相比,其受紫外損傷的生存曲線向右移,說明PPW飼喂可以顯著提高線蟲對抗紫外損傷的能力。PPW對線蟲紫外損傷影響的統計如表2所示。由表2可知,PPW喂養線蟲可使其平均壽命、最長壽命顯著性增加(P<0.05),壽命最長達到5.31±0.45h,相對空白組,25%、50%和75%的PPW喂養的線蟲平均壽命分別延長21.12%、16.81%和32.96%。綜上可知,PPW可以提高秀麗隱桿線蟲的抗紫外損傷能力。

表2 PPW對線蟲紫外損傷影響的統計分析Tab.2 Statistical analysis of effects of PPW against UV damage of Caenorhabditis elegans

圖3 PPW對線蟲紫外損傷的生存曲線Fig.3 Survival curves of PPW against UV of Caenorhabditis elegans

2.5 PPW對線蟲體內MDA的影響

MDA是衡量氧化損傷程度的指標,反映過氧化程度,其為自由基與脂質發生過氧化而產生的物質,具有細胞毒性,影響線粒體呼吸鏈復合物及線粒體體內關鍵酶的活性,從而影響機體壽命[25]。PPW對線蟲體內MDA含量的影響如圖4所示。由圖4可知,PPW可以顯著降低MDA的含量(P<0.05)。當PPW的含量為25%時,與空白組相比MDA降低最為明顯,隨著PPW含量的增加,MDA含量上升達到平衡,說明PPW降低線蟲體內的MDA且沒有濃度依賴性。綜上可知,PPW可以降低MDA對線蟲細胞的毒害作用、減少細胞損傷、延緩衰老。這可能與水提取液中多糖含量較高相關。黃少杰等[26]研究發現鐵皮石斛葉多糖可通過減緩細胞氧化損傷,進而發揮其延長壽命的功效。

注:不同的字母代表差異顯著,P<0.05。圖4 PPW對線蟲體內MDA含量的影響Fig.4 Effect of PPW on MDA content in Caenorhabditis elegans

2.6 PPW中主要成分分析

PPW中多糖、總酚、總黃酮、蛋白質分別為54.30±3.39、15.52±0.53、13.52±0.90、13.87±0.30mg/g,亦即PPW中含量最多的為多糖類物質,其次為總酚、蛋白質及總黃酮。

3 討論與結論

3.1 討論

研究發現,天然植物里面的許多天然化學物質具有抗氧化、抗炎、抑菌等藥理活性,并且可以調節氧化應激、延緩衰老。黃少杰等[26]研究發現鐵皮石斛葉多糖能夠提高秀麗隱桿線蟲抗應激能力和減緩細胞氧化損傷,進而發揮其延長壽命的功效。王猛等[27]研究發現褐藻多糖可通過延長秀麗隱桿線蟲的壽命,提高其運動能力,提升線蟲抗氧化酶活性,調控關鍵基因的表達。熊磊[28]發現枸杞多酚提取物能增強秀麗隱桿線蟲在紫外條件下的應激能力,從而延緩秀麗隱桿線蟲的衰老。陳宇[22]研究發現銀杏葉黃酮提取物可以通過改善線蟲運動狀況、抗氧化能力等,從而發揮延緩衰老的作用。綜上所述,PPW延緩秀麗隱桿線蟲衰老,可能是狐臭柴葉水提取液中多糖、多酚、黃酮等活性物質相互作用的結果。

3.2 結論

為了研究狐臭柴葉水提取液對秀麗隱桿線蟲的抗衰老活性,以模式生物秀麗隱桿線蟲作為研究對象,測定狐臭柴葉水提取液對秀麗隱桿線蟲自然壽命、蟲體長度、運動能力、紫外應激能力及丙二醛含量的影響,以苯酚-硫酸法、酒石酸鐵法、硝酸鈉-硝酸鋁法及考馬斯亮藍法分別測定PPW中多糖、總黃酮、總酚、蛋白質的含量,對PPW延緩線蟲衰老的機理做了初步研究。結果表明與空白組相比,當PPW含量為25%、50%、75%時,延長了秀麗隱桿線蟲平均壽命的13.83%、16.42%、12.27%,在紫外損傷條件下延長了線蟲平均壽命的21.12%、16.81%、32.96%。顯著增強了線蟲的運動能力、延長了蟲體長度、顯著降低了線蟲體內丙二醛的含量。綜上所述,狐臭柴葉水提取液可以延緩秀麗隱桿線蟲的衰老、降低體內丙二醛含量、促進線蟲生長發育、提高運動能力和抗紫外應激能力。該結論可為狐臭柴資源的綜合開發利用提供參考。