腺苷對大鼠離體脊髓運動神經元突觸傳遞的影響

劉 靜,汪萌芽

(皖南醫學院 細胞電生理研究室,安徽 蕪湖 241002)

腺苷(Adenosine)是一種廣泛存在的神經調質,與運動調控、學習記憶和睡眠、認知障礙等調節有關。在中樞神經系統中腺苷廣泛分布于大腦皮層、海馬、小腦、腦干和脊髓等部位[1]。腺苷A1、A2受體主要表達于脊髓背角、腹角和中央管周圍區[2]。腺苷對于急、慢性疼痛和神經病理性疼痛[3-4]發揮著重要的鎮痛作用。腺苷通過刺激Schaffer側支纖維降低大鼠海馬CA1區域誘發反應的長時程增強(long-term potentiation,LTP)[5],還可通過刺激苔蘚纖維降低大鼠海馬CA3錐體細胞誘發的場興奮性突觸后電位的LTP[6]。腺苷抑制中樞神經系統不同區域神經元的自發電活動[7],以及外周神經系統、嗅覺腦切片中誘發的突觸活動[8]。腺苷調節哺乳動物脊椎運動控制的輸出[9],對運動控制起著重要的作用。還能使脊髓腹角中間神經元超極化和運動神經元(Motoneuron,MN)去極化[10]。但腺苷在脊髓內在調控通路和下行激活通路中對運動控制的輸出是否存在差異性。故本研究擬從腺苷對脊髓MN突觸傳遞的影響來探究腺苷對脊髓內在調控通路和下行激活通路的影響。本實驗運用脊髓切片MN細胞內記錄技術,對同側腹外側索(ipsilateral ventrolateral funiculus,iVLF)和同側中央管周圍區(ipsilateral pericentral canal,iPCC)施加電刺激在MN誘發突觸反應,分析腺苷對iVLF-EPSP和iPCC-EPSP的影響。為進一步了解腺苷對脊髓MN運動控制的調節及其機制提供參考。

A.RP=-65 mV;B.腺苷影響MN自發放電頻率的統計圖

A.Control:對照,RP:靜息電位,Clamped:手動鉗制膜電位至RP水平,圖中右側數字表示膜電位的變化;Wash:ACSF沖洗(RP=-65 mV);B、C.腺苷對同細胞MN iVLF-EPSP和iPCC-EPSP幅度和曲線下面積影響的統計圖

1 材料與方法

1.1 實驗動物與脊髓切片的制備 選取8～14 d齡新生Sprague-Dawley(SD)大鼠,雌雄不拘,均由浙江省杭州醫學院生產提供[動物生產許可證號:SCXK(浙)2019-0002]。根據本實驗室已報道方法[11],取SD新生大鼠乙醚麻醉后,分離出腰骶膨大處的脊髓段,用振蕩切片機(Vibratome 1500)切取(400～500 μm)的脊髓橫切片若干,室溫下(25±3)℃置于通入95%O2和5%CO2混合氣體飽和的人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)中孵育備用。ACSF配方(mmol/L):CaCl22.4,NaCl 127.0,KCl 1.9,KH2PO41.2,NaHCO326.0,MgSO4·7H2O 1.3,Glucose·H2O 10.0。

1.2 細胞內記錄 取脊髓切片放置在全浸式記錄浴槽中,并固定脊髓切片。在恒流系統下持續灌流混合氣體飽和的ACSF。取充有3 mol/L乙酸鉀,尖端阻抗為60～120 ΜΩ的微電極(FSG12,Dagan Co．,USA),在顯微鏡下對脊髓腹角MN區域進行穿刺。電刺激由三通道電刺激器產生的脈沖,經隔離器以恒壓模式通過同芯雙極刺激電極施加。同芯雙極刺激電極分別放置于脊髓腹根、iVLF和iPCC區域,用于激活腹根纖維、同側iPCC以及iVLF的下行纖維。記錄到的電信號經Axoclamp 900A微電極放大器放大處理后,與DigiData 1400A轉換接口進行連接,用pClampex 10.2軟件進行采樣、顯示和保存。

1.3 藥物 腺苷(Sigma公司)用超純水配制成母液,保存在-20℃冰箱中冷藏備用,使用前用ACSF稀釋到所需濃度進行灌流。

2 結果

2.1 腺苷對離體脊髓MN基本電生理參數的影響 選取靜息電位負于-60 mV,且動作電位有超射,穩定記錄15 min以上的健康細胞,且在腹根施加電刺激記錄到逆行AP鑒定為MN的細胞進行試驗,灌流50 μmol/L腺苷15 min,觀察到MN膜電位去極化(P<0.01)并伴隨膜電阻增大(P<0.05),和AP幅度減小(P<0.01);但手動鉗制到靜息電位后,AP幅度[(64.40±6.45)mV]與用藥前[(66.26±5.75)mV]相比差異無統計學意義(t配對=1.496,P>0.05)。見表1。

表1 腺苷對MN基本電生理參數的影響

2.2 腺苷對MN自發放電的影響 灌流腺苷15 min后可觀察到MN自發放電頻率減少(t配對=5.277,P<0.01),ACSF沖洗后,該抑制作用可被洗出。見圖1。

2.3 腺苷在同細胞MN上對iVLF-EPSP和iPCC-EPSP的影響 灌流50 μmol/L腺苷15 min可觀察到iVLF-EPSP的幅度和曲線下面積減小(t配對=2.728、2.405,P<0.05);iPCC-EPSP的幅度和曲線下面積減小(t配對=3.405、2.621,P<0.05),且作用可逆。其他參數的差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.4 腺苷對脊髓MN iVLF-EPSP的濃度依賴性影響 累積灌流10、50、250 μmol/L腺苷各15 min觀察到腺苷可濃度依賴性降低iVLF-EPSP的幅度(P<0.01),ACSF沖洗后可恢復。見表2、圖3。

Control:對照,RP:靜息電位,Clamped:手動鉗制膜電位至RP水平,圖中右側數字表示膜電位的變化;Adenosine:累積灌流10、50、250 μmol/L各15 min;Wash:ACSF沖洗(RP=-65 mV,每一條記錄線為1 min內10次記錄的平均線)。

表2 腺苷對MN iVLF-EPSP電生理參數的影響

2.5 腺苷對脊髓MN iPCC-EPSP的濃度依賴性影響 累積灌流10、50、250 μmol/L腺苷各15 min觀察到腺苷可濃度依賴性降低iPCC-EPSP的幅度(P<0.01),ACSF沖洗后可恢復。見表3、圖4。

Control:對照,RP:靜息電位,Clamped:手動鉗制膜電位至RP水平,圖中右側數字表示膜電位的變化;Adenosine:累積灌流10、50、250 μmol/L各15 min;Wash:ACSF沖洗(RP=-65 mV,每一條記錄線為1 min內10次記錄的平均線)。

表3 腺苷對MN iPCC-EPSP電生理參數的影響

2.6 腺苷對MN iVLF-EPSP表觀受體動力學的影響 灌流腺苷15 min后觀察到表觀結合速率常數K1、表觀解離速率常數K2和表觀平衡解離常數KT均無明顯改變(t配對=1.039、1.408、0.635,P>0.05)。見圖5。

一個記錄到MN后灌流腺苷處理前(黑色線)、后(紅色線)的iVLF-EPSP(RP=-65mV);B～D.對用藥前后iVLF-EPSP表觀受體動力學各參數分析圖,

2.7 腺苷對MN iPCC-EPSP表觀受體動力學的影響 灌流腺苷15 min后觀察到表觀結合速率常數K1、表觀解離速率常數K2和表觀平衡解離常數KT均無明顯改變(t配對=1.000、1.741、1.900,P>0.05)。見圖6。

一個記錄到MN后灌流腺苷處理前(黑色線)、后(紅色線)的iPCC-EPSP(RP=-65mV);B～D.對用藥前后iPCC-EPSP表觀受體動力學各參數分析圖,

3 討論

腺苷是一種廣泛存在的神經調質,屬于G蛋白偶聯受體,目前已被證實有4種受體,即A1、A2A、A2B和A3受體[12]。本實驗運用細胞內記錄技術,觀察到灌流50 μmol/L腺苷使MN膜電位去極化并伴隨膜電阻增大、AP幅度減小,但手動鉗制膜電位至靜息電位后,AP幅度與用藥前相比未發生具有統計學意義的變化,表明腺苷可能并不直接影響AP,而是產生細胞膜電位去極化導致AP幅度的減小。而觀察到的這種去極化現象與文獻報道一致[10],即腺苷降低了突觸前末梢釋放遞質的概率,使運動神經元去極化。腺苷介導的MN去極化并伴隨膜電阻的增大可能與激活腺苷受體導致脊髓運動神經元K+通道關閉并激活Ca2+通道有關。而腺苷降低MN自發放電頻率,可能與超極化后電位有關,有證據表明腺苷可增強超極化后電位,這很大程度上是由鈣依賴性鉀電導的增加所介導[13-14]。提示腺苷可能通過增強鈣依賴性鉀電流來減弱MN的興奮性。腺苷可減小iVLF-EPSP和iPCC-EPSP的幅度和曲線下面積(P<0.05)。而腺苷對EPSP的抑制作用,可能與A1R的激活使興奮性神經遞質的釋放減少有關,A1R介導的抑制突觸傳遞,其機制被認為依賴于A1R與抑制性N型鈣通道的偶合[15-16],從而減少中樞突觸中由刺激所誘發的谷氨酸釋放[17-18],這種通過同時控制N型鈣通道和NMDA受體來影響對興奮性刺激的反應[19-20],進而調節突觸活動。其中A2AR藥理學的激活可以調節NMDA受體的功能,故我們推測腺苷對脊髓MN突觸傳遞的影響可能涉及A1R和A2R,其中以A1R為主。表觀受體動力學分析是反映遞質與受體結合的動力學過程。分析用藥前后腺苷對iVLF-EPSP和iPCC-EPSP表觀受體動力學參數值盡管有變化但無統計學意義,尚不能證明腺苷對突觸后受體親和力的影響,進而提示影響谷氨酸遞質的釋放等影響突觸傳遞的可能性。具體的受體機制仍需在后續的研究和分析中予以明確。

綜上,腺苷可以通過抑制脊髓內在調控通路和下行激活通路向運動神經元的突觸傳遞而調控脊髓運動控制的輸出。而進一步分析腺苷對脊髓內在調控神經元通路和下行激活通路突觸傳遞影響的作用機制有助于我們深化對脊髓突觸傳遞的認識,也為臨床治療SCI等運動障礙性疾病提供用藥依據。