循環腫瘤DNA在消化系統腫瘤中的應用

于明鑫 楊愛明

(中國醫學科學院北京協和醫學院北京協和醫院消化內科,北京 100730)

目前我國常見的腫瘤標志物如癌胚抗原、CA19-9對于消化系統腫瘤的敏感性和特異性均不高[1]。液體活檢主要包括血漿游離DNA(circulating free DNA, cfDNA)、循環腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)、微小RNA(microRNA, miRNA)、外泌體(exosome)。液體活檢的檢測標本來源較廣,包括血液、尿液、腦脊液、胸腔積液、腹腔積液、唾液等體液[2]。1948年,Metais和Mandel[3]首次發現血液中片段的DNA,即cfDNA。1994年, Caldas等[4]首次在胰腺癌患者cfDNA中檢測到存在KRAS突變,證實了攜帶突變信息的cfDNA來自于腫瘤細胞。循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)屬于cfDNA的一種,是指由腫瘤直接分泌,或通過凋亡或壞死的腫瘤細胞釋放,也可由外泌體釋放。循環腫瘤DNA作為指導臨床決策的生物標志物,應用于消化系統早期癌癥的篩查和診斷、指導治療、監測治療效果、分析術后殘余病灶及預防疾病復發等方面[1, 5]。本文主要對ctDNA的生物學特征、檢測方法以及其在消化系統腫瘤中的應用進行闡述。

1 ctDNA的生物學特性

ctDNA是由原發腫瘤細胞、原發腫瘤組織及轉移灶通過凋亡或壞死的腫瘤細胞釋放到血液中,或由腫瘤直接分泌釋放到血液中。ctDNA是攜帶腫瘤突變片段的cfDNA,含有腫瘤特異性基因特征和表觀遺傳學特征,且具有較高的組織和細胞類型特異性,可作為生物標志物。ctDNA檢測與傳統腫瘤標志物檢測方法相比,具有簡單、實時、微創、可重復的優勢[6]。ctDNA攜帶的腫瘤基因組信息與腫瘤組織所攜帶的腫瘤基因組信息一致,因此ctDNA檢測可以克服腫瘤異質性的相關問題。ctDNA存在單鏈DNA、雙鏈DNA或單雙鏈混合DNA等形式,可見于血液、腦脊液等體液。不同形式產生的ctDNA大小不同,通過細胞凋亡產生的ctDNA片段大小一般在70～200 bp,通過細胞壞死產生的DNA通常在200 ～ 21 000 bp。因血液中的ctDNA半衰期較短,一般為15 min ～ 2 h,其迅速通過循環酶、巨噬細胞等多種方式降解,故可首選血漿ctDNA用于實時監測。

ctDNA攜帶腫瘤特異性基因特征和表觀遺傳學特征,包括基因突變、染色體重排、拷貝數變異和甲基化改變等。甲基化修飾在腫瘤形成早期發生,同時甲基化修飾具有組織特異性,故通過檢測血液中ctDNA的甲基化可實現早期癌癥的篩查和診斷。

2 檢測方法原理及特點

ctDNA含量較少,僅占cfDNA的0.01%,檢測ctDNA需要高靈敏度、高通量的檢測技術。目前常用的檢測技術包括聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)和二代測序(next generation sequencing, NGS)[7]。

2.1 PCR

2.1.1 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)

qRT-PCR技術,是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。目前大多數商品化的ctDNA檢測試劑盒的原理都是基于qRT-PCR技術,如TherascreenTMEGFR plasma RGQ PCR試劑盒(Qiagen公司,德國)、cobas EGFR Mutation Test v2試劑盒(Roche公司,瑞士)和Super ARMS EGFR檢測試劑盒(中國艾德生物)?；趒RT-PCR的檢測技術檢測靈敏度達到了98%～100%,特異度達到了99.9%～100%。該檢測方法優點是操作簡單,成本低,缺點是通量低、無法檢測未知突變[8]。

2.1.2 數字PCR(digital PCR, dPCR)

dPCR的原理是將一個樣本充分稀釋,分配到不同的反應單元,每個單元包含少于或等于一個拷貝的目標分子,在每個反應單元中進行單獨、平行的PCR反應,不同于qRT-PCR對每個循環進行實時熒光測定的方法,dPCR 技術是在擴增結束后對每個反應單元的熒光信號進行采集,通過將PCR擴增的指數性質轉化為線性呈現,以提高檢測靈敏度,實現絕對定量及稀有等位基因的檢測。根據稀釋策略的不同分為微腔或微滴式。其中基于液滴的數字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)利用分散在油中的水滴作為PCR反應單元,根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例得出靶分子的起始拷貝數或濃度,檢測靈敏度可達到0.1%以上。dPCR檢測方法成本低,靈敏度高,是ctDNA 使用最廣泛的檢測技術之一。缺點是檢測通量低且不能檢測未知突變[9-10]。

2.1.3 BEAMing(bead, emulsion, amplification, magnetics)

BEAMing結合數字PCR與流式技術,通過磁珠克隆DNA。利用特異性PCR 引物擴增目標突變區后,與磁珠(磁珠上固定有特異的PCR 引物)混合進行油包水單分子擴增反應。反乳化作用后,利用熒光探針結合磁珠上的PCR 產物,發出不同顏色熒光。使用流式細胞儀分析磁珠顏色來確定突變情況。BEAMing技術的應用實現了低至0.01%的腫瘤實變的超敏檢測。但BEAMing技術操作程序復雜,且存在通量低及不能檢測未知突變的缺陷[10]。

2.2 NGS

NGS技術可對未知突變基因進行篩查,具有高通量、高特異度、高精度的特點, 可用于腫瘤早期診斷、分析術后殘余病灶及預防疾病復發,但在低濃度標本、低頻突變中仍需提高靈敏度。Liu等[11]曾通過NGS技術檢測結直腸癌中的單核苷酸變異數(single-nucleotide variation, SNV)證實了NGS可用于追蹤原發和轉移病灶。

2.2.1 全基因組測序(whole genome sequencing, WGS)和全外顯子測序(whole exome sequencing, WES)

WGS和WES技術通過評估整個腫瘤基因組或外顯子區,可以從頭識別分子改變,包括拷貝數變異、結構重排和單核苷酸取代。其優勢在于檢測通量高且能檢測未知突變。但因為等位基因頻率低于5%的檢測覆蓋率相對較低,導致WGS和WES分析ctDNA中罕見突變的靈敏度低且成本較高[12]。

2.2.2 全基因組亞硫酸氫鹽測序(whole genome bisulfite sequencing, WGBS-Seq)

血漿中甲基化對于癌癥的診斷靈敏度為74%,特異度為94%,具有較好的癌癥診斷應用價值。WGBS-Seq是DNA甲基化分析的金標準。其原理是用重亞硫酸鹽處理,將基因組中未發生甲基化的 C 堿基轉換成 U,進行PCR擴增后變成T,與原本具有甲基化修飾的 C 堿基區分開來,再結合高通量測序技術,與參考序列比對,即可判斷 CpG/CHG/CHH 位點是否發生甲基化,特別適用于繪制單堿基分辨率的全基因組 DNA 甲基化圖譜,準確率高。缺點是DNA可能存在不同程度的降解,檢測靈敏度可能會降低,且檢測成本較高[13]。

2.2.3 安全測序系統(safe-sequencing system, Safe-SeqS)

Safe-SeqS是一種改進的NGS技術,為每個模板分子分配一個唯一標識符(unique molecular identifier, UMI),可以顯著提高靈敏度和準確率。這種方法的特異度目前受到PCR步驟中使用的聚合酶保真度的限制[14]。

2.2.4 標記-復制子深度測序(tagged-amplicon deep sequencing, TAm-Seq )

TAm-Seq的基本原理是設計特異性引物對目標區域進行循環預擴增,產生200 bp以下末端重疊覆蓋整個區域的擴增子(預擴增),接著通過單重PCR選擇性擴增帶突變的擴增子區(標簽擴增),從而排除非特異性產物,最后在回收的產物上加接頭和特異性條形碼,進一步通過單端測序得到最終結果。該檢測技術的主要特點是測序通量高,可以同時對數百萬個DNA分子進行測序,可檢測未知突變,測序時間和成本顯著降低,檢測靈敏度和特異度達到97%左右[15]。

2.2.5 癌癥個體化深度測序 (cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPP-Seq)

CAPP-Seq技術是先在腫瘤基因突變數據庫中尋找重復出現的突變相關的外顯子,再從腫瘤基因圖譜庫患者全基因組測序結果中篩選突變,設計探針,靶向富集含常見突變基因中的外顯子和內含子,有效地把測序區段濃縮到整個基因組大小的0.004%,使得后續超高深度測序得以實現。其對ctDNA 檢測靈敏度達到85%,特異度達到96%[16]。

3 在消化系統腫瘤中的應用

消化系統腫瘤是多種基因突變的結果,對人類的健康產生深遠的影響。因此,對于消化系統腫瘤早期癌癥的篩查和診斷尤其重要。ctDNA檢測具有顯著優勢,通過比較CTC、miRNA等常見液體活檢檢測方式,ctDNA具有較好的靈敏度和特異度,且優于傳統的腫瘤標志物[17-18],如結直腸癌的傳統腫瘤標志物癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)。利用ctDNA檢測對消化系統腫瘤進行早期篩查診斷、治療方案制定、療效檢測、術后殘余病灶及預防疾病復發/預后分析將為消化系統腫瘤患者帶來福音。目前,國內外已批準多項ctDNA檢測相關試劑盒[19-20],詳見表1和表2。

表1 FDA批準的結直腸癌早篩診斷相關ctDNA檢測試劑盒[19]Tab.1 FDA-approved ctDNA test kits for early screening diagnosis of colorectal cancer[19]

表2 國家藥品監督管理局官網檢索的獲批ctDNA甲基化試劑盒[20]Tab. 2 National Medical Products Administration (NMPA)-approved ctDNA methylation test kits[20]

3.1 消化系統早期癌癥的篩查和診斷

表觀遺傳改變通常在腫瘤發生過程的早期出現,包括DNA甲基化、組蛋白修飾。Lofton-Day等[21]的研究顯示,SEPT9基因甲基化與結直腸癌相關,ctDNA甲基化在結直腸癌的早期診斷中起到重要作用,其靈敏度為95.6%,特異度為99.0%。Iyer等[22]的研究顯示,甲基化也適用于肝癌的早期診斷,通過分析肝細胞癌患者血漿和對應腫瘤組織的APC、E-cadherin、FHIT等抑癌基因,發現兩者具有一致性。此外,在發現腫瘤相關突變后,通過檢測ctDNA的CpG甲基化可實現對癌變組織的定位。

3.2 指導治療

精準醫療的核心是制定個體化治療方案,ctDNA蘊含的基因突變信息可方便腫瘤個體化治療靶點的選擇,Gao等[23]的研究顯示腫瘤組織中的HER2擴增與ctDNA中的HER2擴增具有高度一致性。同時在結直腸癌組織中的KRAS突變與ctDNA中的KRAS突變狀態也保持高度一致,均表明ctDNA的評估可成為消化系統腫瘤如胃癌中HER2的潛在替代指標,ctDNA的相關腫瘤突變信息可指導后續相關位點的靶向用藥。Clifton等[24]對未接受抗腫瘤治療的結直腸癌患者的外周血進行ctDNA檢測,發現在4 290例患者中,其中41例患者檢測出45種特異的基因融合,其中包括RET基因融合、FGFR3基因融合、ALK基因融合、NTRK1基因融合、ROS1基因融合和FGFR2基因融合等。在出現基因融合的患者中出現基因組的改變則更常見,通過ctDNA檢測發現特殊基因融合為治療方式提供了新的思路。

CRICKET試驗[25]評估了對一線西妥昔單抗有反應的患者在治療中斷后重新引入西妥昔單抗的益處。ctDNA樣本的回顧性分析[26]數據顯示,持續存在RAS突變的患者(即在再治療前ctDNA中存在RAS突變)不能從重新引入西妥昔單抗中獲益。其他正在進行的臨床試驗,如CHRONOS (NCT03227926)和FIRE-4 (NCT02934529),評估了利用ctDNA指導抗EGFR抗體的再次引入治療。在一項II期試驗中,研究Sym004[包括兩種抗EGFR抗體,伏妥昔單抗(futuximab)和扎妥昔單抗(modotuximab),二者針對EGFR的不同表位]在使用西妥昔單抗或帕尼單抗治療疾病進展的轉移性結腸癌(colorectal cancer, CRC)患者中的療效,ctDNA生物標志物分析顯示,部分患者(野生型RAS、BRAF和EGFR ECDs)受益于Sym004[27]。ctDNA能夠識別大多數接受HER2靶向治療的ERBB2擴增轉移性CRC患者中可能與耐藥性相關的改變。對接受BRAF和EGFR抑制劑聯合治療的BRAFV600E突變的轉移性結直腸癌患者樣本進行的一系列基于ctDNA的分析顯示,在對這些療法產生耐藥性時,MAPK信號通路的組分會出現多種改變。提示MAPK信號的再激活是一種重要的獲得性耐藥機制,并可在ctDNA中追蹤[28]。

3.3 監測治療效果

ctDNA具有可重復性取樣的優勢,因此可在病程中多次評估治療療效,可通過ctDNA檢測實時監測治療效果,通過ctDNA的基礎水平及變化趨勢可評價患者對所選擇治療藥物的反應。Kim等[29]的一項前瞻性II期臨床試驗顯示,61例接受帕博利珠單抗治療的晚期胃癌患者的ctDNA下降水平與預后相關。ctDNA的基因組不穩定性可預測化學藥物治療(以下簡稱化療)和免疫治療在多種消化系統腫瘤中的療效,Xu等[30]發現在晚期胃癌患者中可通過ctDNA基因組不穩定性預測和監測胃癌的治療反應。

3.4 分析術后殘余病灶、預防疾病的復發及預后

ctDNA半衰期短,約15 min～2 h即被降解,因此可實時監測腫瘤治療過程中腫瘤的負荷變化,相較于傳統的腫瘤標志物及影像學,可更早檢測出腫瘤殘余病灶及預防復發。對于消化系統腫瘤,如胃癌,在行根治術后,仍有部分患者會出現局部復發或部分轉移。ctDNA水平與腫瘤負荷及分期均相關,通過檢測已知的ctDNA中特定基因位點、拷貝數水平和異常甲基化,可評價微小殘留病灶(minimal residual disease, MRD),從而起到預后評估和監測復發的作用,Reinert 等[31]研究發現,在結直腸癌患者中采用ctDNA監測可早于影像學檢查平均10個月發現復發。Li等[32]通過ctDNA檢測發現TP53和MET基因擴增可預測胃癌患者的不良預后。Lecomte等[33]發現在結直腸癌患者中CDKN2A啟動子超甲基化及KRAS突變可作為獨立的預后因素。

4 局限性

4.1 目前不同ctDNA的檢測方法各有優缺點

目前ctDNA的檢測方法主要分為以PCR為基礎的技術和以NGS為基礎的技術。以PCR為基礎的幾種技術雖然準確率高,成本低,但是通量低,不能檢測未知突變,未來發展能力有限。以NGS為基礎的技術檢測成本較高。其中對于ctDNA甲基化的檢測,傳統的甲基化檢測技術,對于痕量DNA難以實現高精準度、高靈敏度及絕對定量的檢測,后續可采用更先進的技術,如DNA微陣列芯片發現潛在的腫瘤甲基化標志物。

4.2 ctDNA檢測缺乏統一標準

ctDNA在消化系統腫瘤的早期篩查、動態監測中得到廣泛應用,但ctDNA在外周血中的豐度較低,難以提取和分析,且易受到cfDNA、基因組DNA影響,各個檢測平臺的靈敏度和特異度均有所不同,目前暫缺乏統一的標準,不同實驗室對于ctDNA的檢測結果的可比性較差,亟需統一的判斷標準、制定統一的行業規則以保證結果的可靠性、重復性及準確性。

4.3 對血液樣本保存的要求較高

血液樣本保存不當容易干擾結果判定,采血后若處理不及時則外周血細胞釋放的核酸會影響ctDNA的測定。各階段的處理,包括采血至分離血漿的時間間隔、離心和純化方案、儲存溫度等均會影響最終的測定結果。

5 結論與展望

基于ctDNA作為生物標志物應用于消化系統腫瘤的早期篩查、指導治療、監測治療效果及判斷預后具有巨大的潛力,ctDNA廣泛應用于臨床是必然趨勢,但仍需要大規模、多中心的臨床研究來進一步驗證其應用于不同消化系統腫瘤的有效性、敏感性。

ctDNA將會推動個體化治療及精準治療的進展[34],通過ctDNA檢測腫瘤特異性基因特征和表觀遺傳學特征的變化,并應用于篩查、診斷、治療及判斷預后中,個體化的醫療方式將會為患者選擇最合適的治療方案,ctDNA的個體化的醫療方式將為腫瘤領域帶來嶄新的格局。

在未來,WGS檢測成本的下降將為ctDNA檢測提供更有吸引力的替代方案,取代需要單獨驗證和標準化程序的獨立癌癥診斷測試。從30～35倍的中等測序覆蓋率,將能夠從單個數據集中獲得cfDNA信息,包括從個性化突變跟蹤到組織反卷積的分析可能性。然而,由于甲基化標記是目前主要的組織特異性標識符,可能WGBS為組織反卷積提供了WGS的替代方案。從不同的WGS分析中獲得的復雜數據陣列將代表多維數據,以進行特征提取和各種機器學習[35]。最終,有可能開發出一種能夠區分來自健康個體血液的cfDNA和來自癌癥患者血液的cfDNA的模型。適當的模型建立有利于精細化的腫瘤分類/分型,評估腫瘤發展和識別藥物靶點或耐藥標記,這也將為ctDNA檢測開辟令人興奮的途徑。

此外,近期報道的DNA片段的早期評估新方法——早期攔截片段的DNA評估 (DNA evaluation of fragments for early interception,DELFI)可通過對cfDNA片段模式的全基因組評估來識別cfDNA中的大量異常。DELFI可能有助于識別腫瘤來源的ctDNA,通過將DELFI與cfDNA序列改變的檢測相結合,可顯著提高檢測的靈敏度[36]。ctDNA檢測技術的進步也將為其在消化系統腫瘤的診斷治療方面提供更多助力。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明于明鑫:提出選題思路,查閱文獻,論文撰寫及修訂;楊愛明:提出修訂意見,審校論文。