基于聚偏氟乙烯-三氟乙烯的復合壓電納米粒子用于腦膠質瘤細胞的精準成像與靶向治療

陳治光 張 巍 何 文

(首都醫科大學附屬北京天壇醫院超聲科,北京 100070)

腦膠質瘤是顱內最常見的原發性腫瘤,約占顱內惡性腫瘤的80%,年發病率約為4.63例/10萬人,自1990年至2016年,其發病率增加了17.3%[1]。腦膠質瘤具有高致殘率和高致死率的臨床特點,5年生存率約為5%,給家庭及社會帶來了極大的經濟和醫療負擔[2-3]。隨著相關研究的不斷深入,關于腦膠質瘤的治療逐漸精準化、個體化。目前主要的治療方式是手術切除結合放射治療和化學治療,但由于血腦脊液屏障、血腫瘤屏障、腫瘤的多形性以及腫瘤的多藥耐藥性,現有方法很難大幅改善腦膠質瘤患者的平均生存率[4-5]。聲-壓電動力治療作為一種新穎的治療方式,在體外和體內實驗研究中具有顯著的抗腫瘤效果[6]。在本文研究中,筆者基于壓電材料的正壓電效應,擬通過基于偏氟乙烯(vinylidene fluoride, VDF)和三氟乙烯(trifluoroethylene, TrFE)的共聚物 [poly (VDF-TrFE), P(VDF-TrFE)]有機壓電材料構建一種復合壓電納米粒子,通過外界超聲刺激使其具備一定的電荷用于腦膠質瘤的治療。

1 材料與方法

1.1 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD復合壓電納米粒子的合成

取10 mg P(VDF-TrFE)(30∶70 質量比)粉末均勻鋪平至玻璃容器中,將其置于120℃烘箱內恒溫加熱10 min,然后以1℃/min降至室溫,即獲得重結晶的P(VDF-TrFE)粉末。將上述粉末溶于2 mL 丙酮,制成濃度為5 mg/mL的P(VDF-TrFE)溶液。

取10 mg二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-四氮雜環配體 [1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-poly(ethylene glycol)-tetranitroheterocyclic ligand, DSPE-PEG-DOTA] 溶于三氯甲烷,取10 mg醋酸釓溶于乙酸,將兩種溶液緩慢匯合為反應液,通過pH標準液調節反應液pH為7.4,充分混勻,置于旋轉混合器于室溫下攪拌過夜,通過旋轉蒸發除去有機溶劑,將沉淀重懸于1 mL雙蒸水,過濾除去未溶解沉淀即為DSPE-PEG-DOTA-釓造影劑 (DSPE-PEG-DOTA-Gd)。

按摩爾比為1∶1的DSPE-PEG-馬來酰亞胺脂 (DSPE-PEG-maleimide, DSPE-PEG-Mal) 和精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸合成肽 (Arg-Gly-Asp, RGD) 溶于500 μL的二甲基亞砜 (dimethyl sulfoxide, DMSO),置于37℃恒溫箱攪拌過夜,通過點擊化學反應即獲得DSPE-PEG-Mal-RGD。

將DSPE-PEG-DOTA-Gd和P(VDF-TrFE)按一定摩爾比溶于丙酮,然后加入一定量的DSPE-PEG-Mal-RGD,劇烈攪拌,并使用尖端超聲儀分散10 min,將上述混合溶液置于旋轉混合器攪拌過夜(15 r/min,37℃);通過旋轉蒸發除去大部分有機溶劑,將殘余溶液進行離心(2 500g,4 ℃,30 min)得到沉淀,將沉淀溶于超純水并以相同離心參數洗滌3次,即獲得P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD。

1.2 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD復合壓電納米粒子的表征

通過動態光散射(dynamic light scattering,DLS)對粒子粒徑和ζ電位進行表征,即取一定量濃度為2 mg/mL的P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD溶液用雙蒸水稀釋為200 μg/mL的待測溶液,充分混勻后置于樣品池中,分別設置檢測目標為粒子粒徑和ζ電位,每個樣品以6/次循環檢測。

通過掃描電子顯微鏡對其形貌進行表征,即取一定量濃度為2 mg/mL的P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD溶液稀釋后滴于1.0 cm × 1.0 cm的硅片,自然風干,通過離子濺射儀鍍金20 s后進行拍照。

通過X-線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)對其成分進行表征,即取一定量濃度為2 mg/mL的P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD溶液滴于錫紙上,待樣品自然風干后進行XPS分析。

通過壓電響應力顯微鏡對其壓電性能進行表征,取一定量濃度為2 mg/mL的P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD溶液,通過旋涂的方法將其固定于2 cm × 2 cm的導電硅片上,在壓電響應力測試模式下隨機選擇1 μm × 1 μm的區域進行壓電系數、壓電勢能的表征。

通過小動物磁共振成像儀對其磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI) 能力進行表征,簡言之,通過計算Gd離子濃度,將其制為Gd濃度為0.1、0.2、0.4及0.6 mmol/L的溶液。

1.3 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD復合壓電納米粒子細胞生物相容性檢測

通過U87-MG、A172、U251腦膠質瘤細胞系評估P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD的生物相容性,簡單地說,將對數生長期的細胞按4×104/孔濃度接種于96孔板中,細胞貼壁后將P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD按0、25、50、75、100、200、300、400及500 mg/mL的濃度與細胞共孵24 h,隨后進行 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT]實驗評估細胞活性。

1.4 超聲刺激下P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD對膠質瘤細胞的殺傷作用

為評估單獨超聲刺激后細胞活性變化情況,設置超聲參數為頻率1 MHz、聲強1 W/cm2、占空比20%,取對數生長期的細胞按4×104/孔濃度接種于96孔板中,細胞貼壁后,分別給予超聲刺激0、10、20、30、40及50 min,于刺激后24 h進行MTT實驗評估超聲對細胞的殺傷作用。

將納米粒子按不同濃度與細胞共孵24 h后,給予有效超聲刺激,于治療后24 h行MTT實驗評估超聲聯合納米粒子對細胞的治療作用。

1.5 超聲刺激下P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD對膠質瘤細胞凋亡、遷移和侵襲能力的影響

通過流式細胞術定量分析各個實驗組發生早期、晚期細胞凋亡的情況;通過傷口愈合實驗評估在相應處理后48 h細胞的遷移能力;通過細胞侵襲實驗(Transwell assay) 評估48 h時細胞穿過Transwell小室的數目。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD的粒徑和電位

根據DLS表征可知P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD復合壓電納米粒子粒徑為(226.8±2.13)nm(圖1A),而ζ電位為-27.6 mV(圖1B)。P(VDF-TrFE)作為該復合壓電納米粒子合成的原材料,粒子粒徑約為(377.7±5.2)nm(圖1A),ζ電位為-18.7 mV (圖1B)。將P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD溶于不同的溶劑進行粒徑表征,在粒子合成后的第1天、第3天、第7天、第14天和第21天分別進行了DLS檢測,發現該粒子在DMEM中粒徑最穩定,且保持在160 nm左右,且該粒子的ζ電位只有當溶劑是雙蒸水時才能測出。

圖1 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD及P(VDF-TrFE)粒徑及成分表征Fig.1 Characterization of particle size and composition of P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD and P(VDF-TrFE)

2.2 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD的成分分析

通過XPS對P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD元素組成進行分析,由于原材料P(VDF-TrFE)中只含有C、H和F元素,以DSPE-PEG-DOTA-Gd和DSPE-PEG-Mal-RGD進行親水性改善,因此,XPS分析結果在C和F元素的基礎上出現了P元素、Gd元素、N元素、O元素以及Na元素(圖1D)。對P(VDF-TrFE)和P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD的C元素單獨分析,發現P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD中C元素第二峰的結合能有明顯提高(圖1E)。通過多峰擬合可以發現P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD中C元素各價位結合能趨于平穩(圖1F)。

2.3 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD的形貌和壓電性能

通過壓電響應力顯微鏡對P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD的壓電性能進行表征,在外加電場±10 V的作用下,P(VDF-TrFE)和重塑后的P(VDF-TrFE)壓電材料的表面電勢發生了改變,材料表面經過高溫重塑后更為光滑(圖2A),而未重塑的材料表面相對不光平整(圖 2B)。圖2C 是P(VDF-TrFE)的壓電響應振幅圖,可以觀察到壓電材料呈現出典型的蝴蝶形曲線,重塑后的粒子表面電勢明顯增加,約為4.2 mV,而沒有經過高溫重塑的P(VDF-TrFE)材料表面電勢較低,僅約1.1 mV。圖 2D是壓電響應相位圖,說明材料在外加電壓的情況下發生了自發極化,因此被認為具有良好的鐵電特性。

P(VDF-TrFE)壓電納米粒子在掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)下呈現為大小相對均一的球形結構(圖2E),經過晶型重塑和親水性改善后粒子間相對分散(圖2F)。以水作為對照,對P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD復合壓電納米粒子的MRI成像能力進行檢測,當Gd離子濃度為0.4 mmol/L時即有明顯的成像效能,在0.6 mmol/L時成像性能更為明顯(圖2G)。

2.4 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD對細胞的殺傷作用

本文研究設定的超聲聲強為1 W/cm2,頻率為1 MHz,占空比為20%,為明確超聲作用時間對細胞的殺傷作用,分別對腦膠質瘤細胞U87-MG、A172以及U251細胞系進行了0 min到50 min的超聲刺激。發現對于U87-MG和U251細胞系,在超聲作用30 min及以上時,細胞活性明顯減低且與對照組差異有統計學意義(圖3A),而A172細胞系在超聲作用20 min時細胞活性即有顯著降低(P<0.05)(圖3A)。通過復合壓電納米粒子進入細胞時間節點的實驗,發現在24 h時納米粒子與溶酶體發生了明顯的共定位,即說明粒子已經進入細胞(圖3B),通過流式定量分析可知,納米粒子進入細胞的量隨時間延長而增多(圖3C)。

圖3 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD對細胞活性的影響Fig.3 Effect of P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD on cell viability

選擇納米粒子與細胞共同孵育24 h后再給予處理,發現不同濃度的P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD對膠質瘤細胞的殺傷作用效果不同。P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD對U-251和U87-MG細胞系沒有明顯的毒性作用,而當粒子濃度為100 μg/mL時即對A172細胞表現出明顯的毒性作用(P<0.01)(圖3D)。在超聲作用下時,U87-MG和A172細胞系活性明顯受損,就U87-MG細胞系而言,當粒子濃度為300 μg/mL時,細胞活性就顯著低于對照組(P<0.001)(圖3E)。而在超聲作用下,P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD復合壓電納米粒子能產生更多的活性氧,與對照組相比,差異有統計學意義(P<0.001)(圖3F和圖3G)。

2.5 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD對細胞增殖的影響

流式圖中Q1、Q2、Q3、Q4分別對應了壞死、晚期凋亡、早期凋亡和正常健康細胞群體(圖4A)。對照組約有0.18%的細胞群發生了壞死,而約99.8%為健康細胞群;在單獨納米粒子組(健康細胞93.5%,早期凋亡細胞5.05%,晚期凋亡細胞1.23%)和單獨超聲組(健康細胞87.1%,早期凋亡細胞10.8%,晚期凋亡細胞1.54%)中觀察到了輕微的凋亡。然而,在超聲聯合作用下,P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD能引起31.1%的細胞發生早期凋亡, 9.26%的細胞發生晚期凋亡,而健康細胞僅58.2%,與對照組細胞凋亡情況比較差異有統計學意義(χ2=53.165,P<0.001)(圖4B)。

圖4 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD對細胞凋亡、侵襲和遷移的影響Fig.4 Effects of P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD on cell apoptosis, invasion, and migration

傷口愈合實驗表明在24 h時,對照組愈合已超過55%,單獨超聲組和單獨納米粒子組愈合分別約為36.19%和41.35%,而超聲+納米粒子組愈合僅約15.41%,明顯低于其他各組(P<0.01);在24 h時,對照組細胞通過Transwell細胞數約為190個,同等時間內,單獨超聲組和納米粒子組細胞通過Transwell細胞數約為150個,占對照組的78.95%,而在超聲聯合納米粒子組細胞通過Transwell細胞數僅約為51個,約為對照組的26.84%(P<0.01)?；诖?本研究證實了P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD在超聲激發后能夠引起膠質瘤細胞凋亡,同時能夠有效抑制膠質瘤細胞的侵襲和遷移。

3 討論

壓電材料是指在受到機械應力作用后在材料表面發生電荷輸出的材料,且電荷輸出量與應力大小成正比,這種效應又稱為壓電效應[7]。壓電效應的本質是機械能與電能之間的轉化,當機械能作用于壓電材料產生電能時稱為正壓電效應,壓電納米材料可以克服當前電刺激治療的局限性,通過外部機械刺激激活(如超聲波)產生內部電場,在神經調節、細胞增殖中有著重要的作用[8]。壓電納米材料分為有機材料和無機材料,目前研究最多的是無機材料,如鈦酸鋇 (BaTiO3)等,通過超聲激發觸發的聲-壓電動力治療導致腫瘤發生可逆性電穿孔、產生的單線態氧等進一步殺傷腫瘤細胞[9-11]。與傳統的氧化鋅(ZnO)、BaTiO3、鈮酸鋰等無機壓電材料相比,P(VDF-TrFE)有著優異的柔韌性、生物相容性、更高的殘余極化和機電耦合因子,因此被廣泛應用于聲學傳感器[12]、電致伸縮裝置[13]、壓電傳感器[14]等領域中。因其壓電性能相對較弱,目前應用最為廣泛的是將P(VDF-TrFE)制備為薄膜在體外進行相關研究[15-18]。P(VDF-TrFE)親水性差[19],目前將P(VDF-TrFE)制成納米粒子用于體內的研究尚少,Pucci 等[20]將抗腫瘤治療藥物Nutlin-3搭載于功能化后的P(VDF-TrFE)納米粒子,在外部超聲的激發下產生了優異的壓電電勢并激活細胞凋亡和抗增殖途徑,與Nutlin-3聯合引起的電化學效應對膠質瘤細胞產生了有效的殺傷作用,這項研究開辟了P(VDF-TrFE) 材料應用領域的新方向,即將其以納米粒子的形式直接作用于細胞,有望實現通過壓電效應刺激組織生長或殺傷靶細胞。

P(VDF-TrFE)粒子有著多種晶型,在常溫下以α晶型為主,然而β晶型含量越多其壓電性能越好。通過加熱、拉伸或施加強電場等方式均可使α晶型轉變為β晶型,即晶型重塑。有學者[21-22]通過對P(VDF-TrFE)薄膜進行熱退火處理獲得了更好的結晶相,即獲得了更多的β晶型從而增加了材料的極性進而獲得了更好的壓電性。同時,研究[19,23]發現通過溶液共混法或表面涂層法可對PVDF材料進行改性。因此,在本文研究中,筆者通過熱退火處理對P(VDF-TrFE)粒子的晶型進行重塑,以DSPE-PEG-Mal-RGD和DSPE-PEG-DOTA-Gd改善其親水性。

在本文研究中,筆者基于P(VDF-TrFE)壓電納米材料制備了兼具MRI成像功能與靶向治療腦膠質瘤細胞的復合壓電納米粒子,該粒子有著穩定的粒徑,尤其是在DMEM溶液中,這可能是由于DMEM中含有大量的氨基酸(如苯丙氨酸、賴氨酸)和葡萄糖,它們可吸附于納米材料表面形成一層吸附分子,避免了納米粒子間的互相聚集,從而增加了粒子的穩定性[24-26]。而該粒子的ζ電位只有在雙蒸水中能夠測出,0.9%NaCl、PBS和DMEM溶劑中有著大量的Na+、K+等,電荷的排斥作用會導致納米顆粒的帶電量變小,使ζ電位達到等電點,從而不穩定,以至于不能獲得ζ電位圖[27-28]。重要的是,該粒子在超聲作用下可以產生一定量的活性氧,從而誘導細胞發生凋亡,并且影響細胞的侵襲和遷移能力。其作用機制可能是因為電刺激通過影響K+通道抑制了細胞分裂,并在細胞分裂過程中干擾細胞骨架的形成,尤其在有絲分裂過程中干擾紡錘體的形成[29-31]。同時,低強度電刺激能夠在不使用任何藥物的情況下影響細胞增殖,而且可以通過影響多耐藥蛋白的質膜異位來降低腫瘤細胞的耐藥性[32]。

總之,本文研究構建的P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD復合壓電納米粒子可以作為一種MRI顯像劑,在精準、個體化治療中可實現分子影像的實時引導,同時該納米粒子作為一種聲敏劑可用于癌細胞的聲動力治療,在雞尾酒療法中具有潛在應用價值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明陳治光:設計研究方案,數據分析,撰寫論文;張巍、何文:提出研究思路,總體把關,審定論文。