新型同種異體骨修復骨缺損對動物生理生化指標的影響

朱力鳴 焦 昆 劉 偉 李勝利*

(1.首都醫科大學實驗動物部,北京 100069,2.北京化工大學材料科學與工程學院,北京 100029)

在臨床治療中,因外傷、退行性病變、先天畸形、骨腫瘤、種植牙、牙周疾病、開顱手術等各種原因導致的骨缺損十分常見,尤其在骨科、口腔科、神經外科等領域的患者較為集中。在患者伴隨有疾病的情況下或骨缺損超過臨界尺寸時,缺損部位很難通過自身的再生修復,此時則需要外加治療性干預[1-2]。據統計,我國每年約400萬人需要進行植骨治療[3]。

根據骨移植材料在體內的骨形成特性,理想的植骨移植材料應具有骨生成性、骨誘導性、骨引導性[4]。組織工程學和生物材料學被認為是發展再生移植修復骨缺損的重要方式。單純的人工骨材料僅能作為骨引導的支架,缺乏誘導成骨能力,成骨速度慢,效果欠佳,需植入有骨誘導性或骨生成性的移植材料。組織工程學將生物材料、細胞以及生物活性分子結合起來,能夠恢復或改善受損或病變組織的生物功能[5]。在組織工程學中,為了提高細胞活力、附著、增殖和歸巢、成骨分化、血管生成、宿主整合和承重[6],學界研究了包括硫酸軟骨素在內的大量的支架材料[7-9]。傳統的骨組織工程研究通過將種子細胞接種在支架材料上植入骨缺損處進行修復,但這種方式存在種子細胞凋亡、引發免疫炎癥反應等缺陷,這將削弱修復效果[10]。為解決此不足,有學者[11]提出“原位組織工程”的概念,構建具有高成骨響應的材料,通過身體的再生潛力加速誘導缺損部位的修復過程。人工骨替代材料也具有各自的優勢和缺點,磷酸鈣陶瓷與骨有著相似的化學組成,但其溶解性影響破骨細胞的活性[12],高分子聚合物具有生物活性但機械強度低[13]。

自體骨移植被認為是骨移植的“金標準”,雖然優勢突出,但其供骨部位的并發癥卻不容忽視。同種異體骨移植盡管也有疾病傳播和免疫排斥等并發癥[14-15]的潛在風險,但隨著相關研究的深入,以及制作技術的改進和提高,其作為異體移植材料的并發癥已顯著降低,目前已成為治療骨缺損的一個重要選擇,成為當前骨移植材料的熱點研究方向。本文研究旨在探討新型同種異體骨材料修補骨缺損過程中對動物體質量、血常規與生化指標的影響,通過實驗組、對照組、空白對照組的比較,對使用該植入材料修補骨缺損的安全性進行評估,為進一步臨床試驗提供數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

成年普通級新西蘭兔,60只,體質量2.2 kg以上,雄性,購自北京富豪實驗動物養殖中心[實驗動物生產許可證號:SCXK(京)2019-0015],飼養于首都醫科大學實驗動物部[實驗動物使用許可證號:SYXK(京)2018-0003],實驗動物質量控制及飼養環境均符合國家相關標準規定[16-17]。采用隨機數字分配法將60只動物隨機分成3組,分別為實驗組、對照組和空白對照組,每組均20只動物。對于上述3組動物,分別在手術后的第1周、4周、8周和12周時取5只動物,測體質量、抽血檢測血常規及生理生化指標。本文研究通過首都醫科大學動物實驗及實驗動物管理委員會批準(動物實驗倫理審查批號:AEEI-2022-083)。

1.1.2 試劑與儀器

供試品:同種異體骨(批號:TZG-S1-211124。型號規格:松質骨小塊,DG-SZGXK,0.5 g;皮質骨粒,DG-PZGL-3,0.5 g),由北京桀亞萊福生物技術有限責任公司提供,干燥避光密閉保存,每次使用前用適量無菌0.9%氯化鈉注射液(以下簡稱生理鹽水)配制供試品,并在2～3 h內使用完畢。對照品:市售同種骨植入材料。主要儀器:SANKYO-CA800全自動全血細胞計數儀,EOS-BRAVO-FORTE全自動生化分析儀,Strong 204精密微型研磨機。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備方法

將兔稱質量后,進行全身麻醉(麻醉劑:氯雷他定片0.03 mL/kg+異戊巴比妥鈉0.1 mL/kg),保定,取側臥位,備皮(半徑約3 cm),消毒,鋪無菌巾。避開皮下血管,逐層切開皮膚、皮下組織及筋膜,切口為2 cm,分離肌群,暴露股骨外側面。在股骨近心端之外緣、大轉子下緣1 cm處,用直徑4 mm球頭精密研磨機制備骨缺損,深度以不打穿髓腔、目視可見紅色骨髓為度(防止骨髓腔開放后暴露的髓內干細胞自愈合能力的干擾)。此時,骨缺損深度約為1 mm,骨缺損體積約為5.24 mm3。制造骨缺損時予以生理鹽水沖洗降溫。用同樣的方法處理對側股骨。在實驗組(供試品)和對照組(對照品)動物的左股骨缺損區填充皮質骨粒,右股骨缺損區填充松質骨小塊,輕壓填緊,盡量使材料與骨缺損密合。分層縫合?？瞻捉M動物進行上述同樣手術,不填充任何材料。術后給予每只動物肌肉注射青霉素鈉溶液80萬單位,連續3 d。

1.2.2 日常觀察

臨床觀察:動物進入實驗室后,每天對其外觀體征和行為活動的情況進行詳細的觀察,包括精神狀況、進食、大小便及口、鼻、眼、耳異常分泌物和被毛等方面的變化進行記錄。

體質量測量:手術前、病理取材前各稱量一次并記錄。

與改款前相同的是，新一代C級車繼續提供長軸距轎車、長軸距運動轎車以及標準軸距運動版三種車型，外觀風格上的升級也讓三款車型的辨識度更高。新一代C級長軸距轎車前杠上的進氣格柵更加寬大，搭配經典的“三線中網”和立標后氣質更顯莊重。新一代C級長軸距運動轎車選擇了AMG風格的外觀，采用星輝格柵、中網大標和AMG車身套件。新一代C級標準軸距運動版則選擇了更簡潔的“雙線中網”與大標搭配，與發動機蓋上的雙凸起棱線和AMG車身套件一起營造出更運動的視覺效果。

1.2.3 血常規及生化指標的檢測

術后第1周、4周、8周、12周對3組動物經后肢隱靜脈取血,抗凝處理后立即進行血液檢測。從后肢隱靜脈取全血約2 mL,注入離心管中,室溫靜置1 h以上,然后離心提取血清用于血清生化指標檢測,分別用以評價供試品、對照品對肝功能、腎功能、血糖、血脂、蛋白代謝和身體酸堿平衡等重要生理指標的影響。

1.3 統計學方法

應用SPSS 22.0軟件對數據進行統計。統計方法為雙因素方差分析,采用LSD多重比較檢驗法進行組間兩兩比較,以確定不同時間點各組的試驗結果差異是否有統計學意義。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 日常觀察

實驗組動物外觀體征、行為活動、毛發光澤、精神狀態、飲食攝入、糞便感觀與對照組和空白對照組存活動物比較無明顯差別。實驗過程中,對照組和空白對照組動物在術后2周時分別出現部分個體死亡。上述死亡動物在術后逐步出現食欲下降,精神萎靡,被毛凌亂,糞便稀軟。經病理剖檢,在上述死亡動物腸道內可見線蟲,身體和器官檢查未見肉眼可見之其他病理變化。鑒于空白對照組動物也出現與對照組動物類似癥狀及死亡現象,綜合考慮,分析其死亡原因可能是麻醉及手術刺激加大了對感染寄生蟲的實驗樣本的影響(按照《實驗動物國家標準》[16]規定,普通級實驗兔并不要求必須排除蠕蟲),導致動物食欲減退,營養不良,最終逐步衰竭死亡。

2.2 體質量

實驗期內,術后一周,3組動物體質量均有輕度下降,下降幅度在0.2 kg到0.4 kg之間,基本上不超過體質量的10%,這是動物對手術的一種應激反應。一周之后,隨著傷口的愈合,手術對動物的不利影響逐步減小,實驗動物體質量多數呈增加趨勢。但在各實驗周期內,實驗組和空白對照組之間體質量變化比較差異無統計學意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 各時間點3組動物體質量變化Fig.1 Changes of body weight of the 3 groups at each time point

2.3 血常規

分析術后1周時血常規中各項指標,實驗組動物中性粒細胞數目與對照組及空白對照組比較,差異有統計學意義(P<0.05),結果詳見表1。其他各項指標均在正常范圍之內,考慮為術后機體正常反應,無病理學意義。

表1 動物血常規檢查結果Tab.1 Results of blood routine examination

4周、8周和12周得到的血常規結果,實驗組動物指標均在正常范圍內,且實驗組各項指標與對照組和空白對照組比較,差異無統計學意義(P>0.05),表明植入供試品對動物的血液系統、造血功能并無不良影響。

2.4 血清生化檢測結果

血清生化項目檢測結果及數據統計分析結果見表2。本次實驗過程中,實驗組各項生化指標基本正常。8周時,實驗組的葡萄糖檢測數據與空白對照組比較,差異有統計學意義(P<0.05),但檢測值均在正常范圍內。實驗第12周檢測,實驗組與空白對照組比較,葡萄糖及三酰甘油兩項指標差異有統計學意義(P<0.05)。原始檢測數據顯示,空白對照組中有一個樣本的葡萄糖檢測數據(12.13 mmol/L)偏離參考范圍(4.17 mmol/L～9.5 mmol/L),導致該組數據平均值偏大(平均值為10.37±1.54);這也是兩組之間三酰甘油檢測值差異出現的原因。第12周時,比較對照組與實驗組的丙氨酸氨基轉移酶檢測值,差異具有統計學意義(P<0.01);對照組與空白對照組比較,二者之間在該指標上差異也具有統計學意義(P<0.05)。究其原因,在于對照品組中有兩個樣本的丙氨酸氨基轉移酶檢測值(分別為124 U/L和133 U/L)遠遠高于參考范圍(5 U/L～106 U/L)。其他各項指標,在三組動物間兩兩比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。

表2 動物血清生化檢查結果Tab.2 Results of serum biochemical examination

分析血清生化指標的實驗數據表明,供試品的植入可能對受體動物的生物化學反應及代謝產生一定影響,但這仍是機體的正常反應,在本文實驗過程中植入供試品對動物肝功能、腎功能、血糖、血脂、蛋白代謝和身體酸堿平衡等沒有產生不良影響。

3 討論

本試驗以成年雄性新西蘭兔為實驗材料,制作骨缺損疾病模型,填充皮質骨?；蛩少|骨小塊以探究骨修復效果。新西蘭兔作為一種封閉群動物,其動物個體之間具有豐富的遺傳異質性,在開展人類遺傳研究、藥物篩選和毒性試驗等方面起著不可替代的作用[18]。其免疫排斥性靈敏,是適合開展同種異體骨移植生物兼容性研究的優選實驗動物。血常規結果顯示,1周時血常規的各項指標,實驗組動物除中性粒細胞稍高于參考值外,其他各項指標均正常;4周、8周和12周時實驗組動物血常規指標均在正常范圍內。淋巴細胞與機體的免疫反應及炎癥密切相關,在細胞免疫及白細胞的趨化作用中發揮著重要作用。中性粒細胞在臨床診斷時被作為判斷急性炎癥的重要指標,多出現于急性炎癥、化膿性炎癥及炎癥早期的循環血液中[19]。實驗組動物炎性細胞檢測數據與空白對照組和對照組兩兩比較,差異均無統計學意義,分析該系列指標的波動為術后機體正常反應,無病理學意義,表明該新型同種異體骨的低免疫誘導性具備一定的植入安全性。血清生化數據表明,實驗組各項生化指標基本正常,僅在4周時實驗組個別動物樣本出現葡萄糖、膽固醇偏高,但這兩項指標的檢測值與空白對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05),分析可能為個體差異所導致。另外,盡管4周時空白對照組中有一個樣本的肌酐和三酰甘油數據偏離參考范圍,致使空白對照組平均值偏離標準值較多,但實驗組與空白對照組比較,二者之間差異無統計學意義(P>0.05)。12周時比較實驗組與對照組的丙氨酸氨基轉移酶檢測值,兩者差異有統計學意義(P<0.05)。但原始檢測數據顯示,該項指標檢測值均在正常范圍內。

本文實驗中動物造模時對局部骨膜造成一定破壞,可能在一定程度上影響局部血供及血管生成,而血管生成在加速骨折愈合中的作用已經成為共識[20]。同時,既往研究[21]認為,骨損傷時可導致微循環障礙,而微循環障礙不僅與血管生成有關,而且與脂質代謝有關,可能導致脂質代謝紊亂[22]。根據本文實驗生化檢查結果分析,供試品的植入可能對受體動物的生物化學反應及代謝產生一定影響,但這種變化并未導致動物出現病理反應,可視為其機體的適應性調節。

本文實驗提示該新型骨修復材料具有一定的安全性和有效性,為后續臨床試驗和應用提供了一定的支持證據。既往研究[20]表明,松質骨的孔隙度和性別具有相關性,本文實驗動物均選用了雄性兔,可能對結果造成一定的影響。另外,本文實驗所使用的材料在修復骨缺損過程中,是否會受到性激素的影響,有待于在后續研究中進一步探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明朱力鳴:動物模型制作,數據分析處理,論文撰寫;焦昆:動物模型制作,數據質量審核,論文審訂;劉偉:提出研究思路,設計研究方案,實驗協調;李勝利:總體把關,論文審定。