超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜測定動物源食品中25種利尿劑

張麗華，劉 琪，李 星，王 羽，林 立，何瑞云，姜 潔

（北京市食品檢驗研究院（北京市食品安全監控和風險評估中心），國家市場監管重點實驗室（食品安全重大綜合保障關鍵技術），北京 100094）

利尿劑類藥物可增加人尿的排泄量，促使積聚在皮下和腹腔中多余的水分在短時間內大量排出，在臨床上可用于治療液體潴留心力衰竭、高血壓以及腎?。?-2］。在動物飼養過程中，利尿劑也可用于治療奶牛乳房炎，或改善禽蛋蛋白比例，減少動物胴體的含水率等［3］。GB 31650-2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》規定可以使用的利尿類藥僅包括氫氯噻嗪和甘露醇2種［4］，其作用是促進腎臟排尿、降低血壓等。由于動物體內的利尿劑殘留可通過食物鏈進入人體，實際使用中存在獸藥、飼料中非法使用食品安全國家標準中未規定允許使用的利尿劑類藥物，以及保健食品中非法添加氫氯噻嗪等利尿劑類藥物的隱患［3，5］。長期食用含有利尿劑類藥物的食品，易造成機體代謝紊亂、損害肝腎功能、神經系統等風險［6］，危害人體健康。

目前，國內外關于利尿劑類物質檢測方法的研究多集中在動物飼料［3，7］、人體尿液［8-9］及血漿［10-11］，化妝品中利尿劑類物質的檢測也有所涉及［12］，我國現行國家標準中規定了化妝品中氯噻酮和螺內酯的檢測方法［13-14］。隨著對食品中利尿劑類物質關注的提升，近年先后發布了SN/T 5167-2019《出口動物源食品中氫氯噻嗪等10 種利尿劑殘留量的測定方法》［15］、GB 31658.25-2022《食品安全國家標準 動物性食品中10 種利尿藥殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》［16］。目前利尿劑的檢測多使用乙腈、乙酸乙酯、甲醇等作為提取試劑，通過液液萃取、固相萃取柱等方式進行凈化，檢測方法包括液相色譜法［17-19］、液相色譜-串聯質譜法［20-22］、氣相色譜-質譜法［23］、光譜法［24-25］等，其中液相色譜、光譜法的靈敏度較低；氣相色譜-質譜法需對樣品進行衍生，實驗步驟較復雜。液相色譜-串聯質譜法因具有較好的靈敏度且前處理過程相對簡便而得到廣泛應用，但涉及的利尿劑種類僅有十幾種，且食品基質多以動物肌肉組織、牛奶為主。高分辨質譜可獲取母離子及子離子精確質量數，通過保留時間和同位素分布等參數具備更好的定性能力。本文以內標法定量，采用超高效液相色譜-串聯高分辨質譜法對動物源性食品中25種利尿劑藥物進行同時測定，方法具有較高的靈敏度，可較好地抵消不同樣品的基質效應，為食品中利尿劑類物質殘留監測提供技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UltiMate 3000Q-Exactive HF-X 超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜（Thermo Fisher公司）；3K30 離心機（德國Sigma 公司）；SONOREX DL 1028H 超聲清洗器（德國Bandelin 公司）；N-EVAP 112 氮吹儀（美國Organomation 公司）；VORTEX 3 渦旋混合器（德國IKA 公司）；ACQUITY HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；Oasis PRiME HLB（6 mL/200 mg，Waters公司）。

托伐普坦、依他尼酸、阿米洛利、丙磺舒、呋塞米、氯噻酮、精磺胺（ACDM）、乙酰唑胺、氯噻嗪、螺內酯、坎利酮、卞氟噻嗪、氨苯蝶啶、芐噻嗪、環噻嗪、甲氯噻嗪、泊利噻嗪、氫氯噻嗪、托拉塞米、環戊噻嗪、依匹噻嗪、甲苯噻嗪、依普利酮、布美他尼、美托拉宗；丙磺舒-D14、呋塞米-D5、氯噻酮-D4、精磺胺-15N2、乙酰唑胺-D5、氯噻嗪-13C15N2、坎利酮-D6、卞氟噻嗪-D5、氨苯喋啶-D5、氫氯噻嗪-13CD2、托伐普坦-D7、依他尼酸-D5、托拉塞米-D7、布美他尼-D5、依普利酮-D3、美托拉宗-D7，購自天津阿爾塔公司，純度均大于95%。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取利尿劑標準品各10 mg（精確至0.1 mg），置于10 mL小燒杯中，用甲醇溶解，轉移至100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，配制成質量濃度為0.1 mg/mL的利尿劑標準儲備液。氨苯蝶啶及氨苯喋啶-D5標準品需先用1 mL二甲基亞砜溶解，再用甲醇稀釋并定容至刻度。

1.2.1 混合標準工作液的配制分別取質量濃度為0.1 mg/mL的托伐普坦、依他尼酸、阿米洛利、氨苯蝶啶、甲氯噻嗪、甲苯噻嗪標準儲備液各100 μL，其他19 種質量濃度為0.1 mg/mL 的利尿劑標準儲備液各50 μL置于同一10 mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，混勻，配制成托伐普坦、依他尼酸、阿米洛利、氨苯蝶啶、甲氯噻嗪、甲苯噻嗪的質量濃度為1 μg/mL，其他19 種利尿劑的質量濃度均為0.5 μg/mL 的25種利尿劑混合標準工作液。

1.2.2 混合內標工作液的配制分別取16 種質量濃度為0.1 mg/mL 的利尿劑內標儲備液各100 μL，置于同一10 mL 棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，混勻，配制成質量濃度為1 μg/mL 的16 種利尿劑混合內標工作液。

1.3 色譜-質譜條件

Waters ACQUITY HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動相A 為0.1%甲酸水溶液，B 相為乙腈；流速0.3 mL/min；柱溫30℃，樣品進樣量為5 μL。梯度洗脫程序：0～2.0 min，95% A；2.0～3.0 min，95%～80% A；3.0～7.0 min，80%～76% A；7.0～10.5 min，76%～70% A；10.5～13.5 min，70%～40% A；13.5～15.0 min，40%～30% A；15.0～18.0 min，30%～15% A；18.0～18.1 min，15%～0% A；18.1～21.0 min，0% A；21.0～22.0 min，0%～95% A。

離子源：加熱電噴霧電離源（HESI）；噴霧電壓3.5 kV（正離子模式），噴霧電壓-3.0 kV（負離子模式），離子傳輸管溫度350 ℃；輔助氣加熱器溫度350 ℃；掃描模式：一級母離子全掃描和數據依賴的二級子離子掃描模式檢測（Full MS/dd-ms2）；一級掃描范圍為m/z100～1 200（正模式），m/z100～700（負模式）；一級質譜掃描分辨率為60 000，二級掃描分辨率為30 000；歸一化碰撞能量為20、30、40 eV；25種利尿劑及16種內標物質的自建篩查數據庫信息見表1。

表1 25種利尿劑及16種內標藥物的質譜參數Table 1 MS parameters for detection of 25 kinds of diuretics and 16 kinds of the internal standards

（續表1）

1.4 樣品前處理

1.4.1 豬、牛、羊及禽類肌肉組織的提取取適量新鮮供試樣品肌肉組織攪碎并均質，稱取2 g試樣（精確至0.01 g）置于50 mL 塑料離心管中，加入100 μL 1 μg/mL 的內標混合工作液，10 mL 80%的乙腈水溶液，渦旋混勻1 min，超聲提取15 min。加入3 mL 正己烷溶液，渦旋混勻，4 ℃下9 000 r/min 離心5 min，取下層清液待凈化。

1.4.2 蛋、奶樣品的提取供試蛋樣品去殼后混合均勻，供試奶樣品充分混合均勻，稱取2 g 試樣（精確至0.01 g）置于50 mL 塑料離心管中，加入100 μL 1 μg/mL 的內標混合工作液，乙腈10 mL，渦旋混勻1 min，超聲提取15 min。4 ℃下以9 000 r/min離心5 min，取上層清液待凈化。

1.4.3 凈化吸取上述待凈化的清液6 mL，以≤1 mL/min 的速率通過PRiME HLB 固相萃取柱。用帶有刻度的玻璃管準確接收流出的樣液5 mL。將收集好的樣液于40 ℃氮吹至近干后，用50%乙腈水溶液定容至1 mL，過0.22 μm的有機尼龍濾膜，濾液供UPLC-HRMS測定。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

配制25 種利尿劑混合標準工作液，采用正負離子切換 Full MS/dd-ms2掃描方式分析，根據前期工作基礎及相關標準和文獻報道［15-16］，加合方式優先考慮［M+H］+及［M-H］-，通過目標物分子式在正負模式分別計算精確質量數，提取離子色譜圖，比較待測物在正負離子模式下的響應強度。結果顯示，托伐普坦、阿米洛利、丙磺舒、螺內酯、坎利酮、氨苯蝶啶、托拉塞米、甲苯噻嗪、依普利酮、布美他尼、美托拉宗在正模式下響應高，母離子均為［M+H］+，其余目標物在［M-H］-模式下響應更高。此外，螺內酯與坎利酮結構相差-C2H4OS基團，進入離子源后，螺內酯的-C2H4OS基團極易脫落，將螺內酯標準工作液單獨進行掃描，其母離子全掃描圖如圖1所示，m/z417.209 3的響應較弱，而m/z341.210 5具有較強的母離子峰，因此選擇其［M-C2H4OS+H］+模式下的理論值341.211 1作為螺內酯的母離子。

圖1 螺內酯的一級質譜圖Fig.1 MS spectrum of spironolactone in full MS mode

2.2 色譜條件的優化

因螺內酯與坎利酮具有相似的結構，且進入質譜后母離子相同，為實現更好的定性效果，利用色譜柱對兩種物質進行分離。在相同液相色譜條件下對50 ng/mL 的25 種利尿劑混合標準溶液進行測定，考察了BEH C18及HSS T3 色譜柱對螺內酯與坎利酮的分離效果，提取m/z341.211 1 離子流圖，結果如圖2 所示。BEH C18色譜柱不能將兩者分離，而HSS T3 色譜柱可實現較好的分離效果，因此本研究選擇HSS T3色譜柱進行分析。

圖2 HSS T3（A）及BEH C18（B）色譜柱的分離效果Fig.2 Separation results by HSS T3（A） and BEH C18（B） columns

2.3 前處理條件的優化

由于動物源食品中含有較多的脂肪和動物蛋白，為避免將樣品中脂肪和蛋白同時提取而影響目標物的提取效果及后續凈化過程，同時考慮到25種利尿劑的極性差異較大，本實驗選取極性適中、穿透力較強的乙腈作為主要提取試劑?？疾炝?%甲酸乙腈溶液、乙腈以及80%乙腈水溶液3種試劑對豬肉肌肉組織、蛋、乳中25種利尿劑的提取效果。結果如圖3所示，1%甲酸乙腈溶液使精磺胺的回收率顯著降低。80%乙腈水溶液與乙腈的提取效果相近，考慮到不同樣品基質的特點及凈化過程的需求，畜禽肉選取80%乙腈水溶液作為提取試劑，含水量稍多的蛋及奶類樣品直接用乙腈提取。

2.4 基質效應

按實驗步驟對豬肉肌肉組織、雞蛋及牛奶進行提取，采用3 種空白基質提取液和50%乙腈水溶液分別配制100 ng/mL的利尿劑標準溶液，測定各利尿劑的質譜響應強度。通過基質配制標準溶液的質譜響應與50%乙腈水溶液標準溶液質譜響應的比值考察基質效應，當比值大于1.2或小于0.8時基質效應顯著。結果如圖4 顯示，在豬肉肌肉組織及牛奶樣品中托伐普坦、乙酰唑胺、泊利噻嗪及依普利酮有明顯的基質增強效應，阿米洛利、精磺胺等多數利尿劑有顯著的抑制作用，為確保方法定量分析的準確性，在實驗過程中運用內標定量十分必要。

圖4 不同樣品中25種利尿劑的基質效應Fig.4 Matrix effects of 25 diuretics in different samples the number denoted was the same as that in Table 1

2.5 方法驗證

分別吸取10、20、50、100、200 μL的混合標準工作液，各加入50 μL混合內標工作液，用50%乙腈水溶液定容至1.0 mL，配制成各內標的質量濃度均為50 ng/mL，且托伐普坦、依他尼酸、阿米洛利、氨苯蝶啶、甲氯噻嗪、甲苯噻嗪的質量濃度為10～200 ng/mL，其他利尿劑的質量濃度為5～100 ng/mL的混合標準溶液。25 種利尿劑的對應內標如表2 所示。在優化條件下，以目標物的母離子峰面積與對應內標物質母離子峰面積比值為縱坐標，標準溶液的質量濃度為橫坐標，繪制25種利尿劑的標準工作曲線。結果顯示，25 種利尿劑在各自線性范圍內線性關系良好，相關系數（r2）均大于0.99，檢出限為5～10 μg/kg。通過添加1 倍、2 倍和10 倍檢出限水平的6 次平行實驗對豬肉肌肉組織、雞蛋、牛奶3 種基質的回收率、相對標準偏差（RSD，n=6）等指標進行考察，結果如表3 所示，方法的回收率為63.0%～116%，RSD為0.80%～14%，滿足方法學要求。

表2 25種利尿劑的線性范圍、線性系數、檢出限及對應內標Table 2 Linear ranges，correlation coefficients（r2），limits of detection（LODs） and the matching internal standards of 25 diuretics

表3 不同樣品基質中25種利尿劑的加標回收率及相對標準偏差（%）Table 3 Recoveries and RSDs of 25 diuretics at three levels in different sample matrices（%）

2.6 實際應用

運用此方法，對豬肉、牛肉、雞肉、蛋、奶等不少于20個市售樣品中的25種利尿劑進行測定，均未檢出。該方法已在畜禽肉肌肉組織、雞蛋、牛奶等動物源性大宗食品中危害物的日常監測以及2019年國際籃聯籃球世錦賽，2022年冬奧會及測試賽等大型賽事的食品安全技術保障中進行了應用。

3 結 論

本研究構建了食品中 25 種利尿劑類藥物的篩查數據庫，建立了基于液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜同時測定畜禽肉、蛋、乳等動物源性食品中25種利尿劑的篩查確證及定量分析方法。該方法操作簡便，實用性強，且方法線性范圍、檢出限、準確度及精密度滿足方法學要求，可為動物源性食品中利尿劑類藥物的日常監管提供技術支撐。