基于網絡藥理學研究紫龍金片治療口咽癌的作用機制

曾 鵬,王紹川,楊子怡,朱培亮,蔡佳宜,鄧雪兒,齊寶平

1.肇慶學院食品與制藥工程學院(廣東 肇慶 526000) 2.湖北民族大學化學與環境工程學院(湖北 恩施 445000)

口咽癌是世界上常見的第6大癌癥,每年新增患者超過30萬,并出現逐年上升的趨勢[1]?？谘拾┑纳L較快,具有較大的破壞性,其癌細胞的轉移是嚴重的并發癥之一,嚴重危及患者生命?？谘拾┲饕苫瘜W因素、感染因素、遺傳因素、環境因素等導致,大量研究表明口腔癌可能與人乳頭瘤病毒(HPV)息息相關。其作用機制主要通過E6和E7基因的異常表達。E6基因的表達水平異常會影響細胞生長調節的功能,而E7基因的異常表達會通過E2F活性因子間接導致機體細胞癌變[2]。目前,對于口咽癌的治療方法仍以手術和放療為主,對其疾病的發生和分子作用機制仍不明確,缺乏深入的分子生物學研究。

紫龍金片的主要成分為半枝蓮,丹參,當歸,黃芪,龍葵,郁金,蛇莓和白英,具有益氣養血,清熱解毒,理氣化瘀等功效,在臨床上常用于治療氣血兩虛證、原發性肺癌化療的患者。在中醫理論的指導下,基于中藥成分的多樣性、分子網絡的復雜性等特點,在癌癥的臨床治療中有成效[3-5]。因此,本研究通過網絡藥理學方法探討紫龍金片治療口咽癌的可行性,并通過分析該藥物與疾病的活性成分與靶點的關聯性得出其治療機制。

1 資料與方法

1.1紫龍金片的活性成分及靶點的預測紫龍金片含8種主要成分,分別為半枝蓮,丹參,當歸,黃芪,龍葵,郁金,蛇莓和白英。在YaTCM數據庫(http://cadd.pharmacy.nankai.edu.cn/yatcm/home)與TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/index.php)中檢索上述藥物的活性成分,并根據口服生物利用度[6](OB)≥0.3、類藥性[7](DL)≥0.18對活性成分進行篩選。將篩選結果導入string數據庫(https://cn.string-db.org/)[8]中進行蛋白質的基因名稱標準化。

1.2檢索口咽癌的相關靶點在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)中將物種設置為“Homo sapiens”,把“oropharyngeal cancer”作為關鍵詞,檢索其相關靶點,并將相關靶點導入至excel表中。

1.3篩選共有靶點及紫龍金片的關鍵成分將藥物靶點與疾病靶點輸入至微生信網站(http://www.bioinformatics.com.cn/)中獲取共有靶點。使用Cytoscape 3.8.0[9]軟件建立“中藥-活性成分-靶點”網絡,以顯示共有靶點與紫龍金片作用在這些靶點上的活性成分之間的關系。分析所得活性成分與靶點的度值,篩選出紫龍金片治療口咽癌的主要活性成分與靶點。

1.4構建共有靶點的蛋白質PPI網絡在String數據庫中,物種設置為“Homo spaiens”,輸入1.3中篩選出的共有靶點,生成蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡,在Cytoscape 3.8.0軟件中進行PPI網絡的可視化,導出數據文件,通過度值進行排序,對核心靶點進行篩選。

1.5共有靶點的基因功能富集分析在David數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)中進行GO分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析,GO分析由生物工程(biological process,BP)、細胞成分(cellular componen,CC)、分子功能(molecular function,MF) 3部分組成。導入藥物與疾病的共有靶點,設置P<0.01篩選出前10個GO條目(包含BP、CC、MF)和前20條KEGG通路,利用微生信網站制作氣泡圖和“KEGG通路—共有靶點”網絡圖,以此對其進行分析[10]。

1.6核心靶點與關鍵成分的分子對接將核心靶點導入RCSB數據庫(https://www.rcsb.org/)[11]中查看其蛋白質3D結構并導出為PDB格式,將其導入SYBYL-X 2.1.1中轉化為mol 2格式文件。然后在SYBYL-X 2.1.1中用核心靶點和關鍵活性成分的分子開展對接,分子對接結合的分值越高,意味著結合的越穩定效果越好。

2 結果

2.1紫龍金片的活性成分及靶點的預測在TCMSP數據庫中,最終檢索到紫龍金片的8個中藥中含有783個成分,包括半枝蓮94個,丹參202個,當歸125個,黃芪87個,龍葵39個,郁金222個,蛇莓8個,白英6個。以OB≥0.3,DL≥0.18為篩選條件,結果得到145個活性成分,2329個靶蛋白。

2.2口咽癌相關靶點將“oropharyngeal cancer”作為關鍵詞錄入至GeneCards數據庫中,得到1836個靶點基因,以“relevance score”為依據,最后篩選出505個靶點基因。

2.3紫龍金片的關鍵成分及共有靶點采用Venny 2.1對二者相關靶點進行繪制(圖1),得到共有靶點106個。根據所得的數據導入Cytoscape 3.8.0,得到“中藥-活性成分-靶點”網絡,見圖2。

圖1 紫龍金片和口咽癌的共同靶點韋恩圖

圖2 “中藥-活性成分-靶點”網絡圖

2.4共有靶點的蛋白質PPI網絡構建在String數據庫中導入共有靶點,將得到的數據導出至Cytoscape 3.8.0軟件可以獲得共同靶點的蛋白質PPI網絡(圖3)。TP53,AKT1,ALB,CASP3,ESR1,MYC為前5位的核心靶點,ESR1與MYC度值一致并列選入。因此這6個核心靶點高度參與了紫龍金片輔助治療口咽癌的過程。

圖3 共同靶點的PPI網絡

2.5共有靶點的基因功能富集分析對106個共同靶點進行GO和KEGG的富集分析(圖4),生物學過程(BP)主要與分泌調控有關,細胞組成(CC)主要與溶酶體(lysosome)、內質網腔(endoplasmic reticulum lumen)、囊泡的運輸等有關,分子功能(MF)主要與信號受體調節活性 (signaling receptor regulator activity)、陽離子的通道活性(cation channel activity)、NF-kappaB結合(NF-kappaB binding)等有關。KEGG富集分析得到的結果如圖5所示,其主要富集于neuroactive ligand-receptor interaction、cAMP、Serotonergic synapse、cGMP-PKG等信號通路。前20個KEGG通路在106個共同靶點中對35個靶點發生作用(圖6)。表明紫龍金片能夠通過多條通路與多個靶點協同下對口咽癌起治療作用。

圖4 GO功能富集分析

圖5 KEGG功能富集分析

圖6 “KEGG路徑-共同目標”網絡圖

2.6核心靶點與關鍵成分的分子對接取3個核心靶點AKT1,TP53與ALB與5種關鍵成分槲皮素、丹參酮IIA、鼠尾草酚酮、木犀草素、甾醇進行15組分子對接實驗。結果按照自由結合能大小均<0,說明關鍵成分與核心靶點之間能夠自由結合。其中結合效果排名前3的分別為AKT1-槲皮素(-4.8kcal/mol),ALB-木犀草素(-5.7kcal/mol),TP53-槲皮素(-6.0kcal/mol)。其中槲皮素與3個核心靶點的結合能力的分數平均值均<-5kcal/mol,說明對接結果良好(圖7)。因此說明槲皮素等關鍵成分起到了治療口咽癌的關鍵作用。

a:AKT1和槲皮素的三維結構圖和二維結構圖;b:ALB和木犀草素的三維結構圖和二維結構圖。

3 結論

紫龍金片主要的功效是清熱解毒、益氣養血,因此氣血兩虛的原發性肺癌化療的患者會使用紫龍金片作為藥物進行治療,紫龍金片也可應用在其他癌癥的輔助治療。本實驗通過在網絡藥理學的基礎上分析了紫龍金片145個活性成分和得到271個靶基因,通過分析Venn圖中交集部分的106個共有靶點和“中藥-活性成分-靶點”圖,以“degree”值的大小為依據分析推算槲皮素,丹參酮IIA,鼠尾草酚酮,木犀草素,甾醇等5個成分為重要的成分和AKT1,TP53,ALB等為關鍵靶點。其中,槲皮素具有多種藥理作用,例如抗炎、抗菌、抗氧化、抗纖維化和清除自由基等[12-13]。文獻研究顯示[14]通過2種方式來抑制癌細胞的增長,分別是誘導凋亡和抑制遷移。近來研究闡明丹參酮IIA具有抗氧化,抗腫瘤及對阿爾茨海默病的治療等作用[15]的類似物還具有抗菌抗炎作用與具有眾多的藥理活性。木犀草素(Luteohn)不僅能夠誘導細胞自我降解和循環利用胞內組分的過程、抑制腫瘤細胞增殖,還能夠形成抗腫瘤的作用,通過在多途徑、靶點、多環節的過程。

在分析共同靶點的蛋白質PPI網絡后能夠得出結論,根據靶點的度值可以選取出TP53,AKT1,ALB,CASP3,ESR1,MYC為前度值排名前5的6個核心靶點,其中ESR1和MYC的度值相同。TP53基因編碼一種包含轉錄激活、DNA結合和寡聚結構域的抑癌蛋白。編碼蛋白對許多種細胞具有通過應激反應和控制靶基因的表達從而誘導細胞分裂異常、還有DNA修復或代謝改變[16]。AKT1是一種蛋白激酶,參與了乳腺癌、前列腺癌等多種癌癥的發生、發展、轉移和復發的多個環節[17]。

結合GO生物過程分析和KEGG富集分析的結果,這些通路包括:PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路和HIF-1信號通路等通路。其中,對PI3K-Akt信號通路的分析,其中共有35個靶點直接與此通路作用。通路的富集結果除了以上腫瘤相關信號通路,前列腺癌和胰腺癌等具體癌癥類型也有具體通路,還有其他病毒感染相關的信號通路,說明這些疾病與腫瘤的通路可能是共通的,要留意在抗腫瘤的同時副作用的產生。最后在分子對接的基礎上,大部分關鍵成分和核心靶點的對接結果較理想,因此認為關鍵成分和核心靶點間存在緊密的聯系。

綜上所述,紫龍金片主要通過槲皮素、木犀草素,甾醇等主要活性成分作用于TP53,AKT1,ALB,CASP3,ESR1,MYC等靶點,其中對TP53,AKT1和ALB的作用較為明顯,參與病毒等相關通路和細胞調節的過程,最終達到抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡,進而達到輔助治療口咽癌的作用,為以后臨床試驗提供了可能性。