膀胱癌組織中ILK、P16表達與臨床病理特征和Cyclin D1的關系

焦凌玉,黃立娜,李曉麗

商丘市第一人民醫院病理科(河南 商丘 476000)

膀胱癌是一種惡性腫瘤,病死率高。相關研究證實[1]腫瘤的發生發展以及轉移等過程較為復雜,細胞周期失控在起重要作用,此外,腫瘤細胞間黏附力下降與之聯系密切。故而,探尋膀胱癌發生發展的關鍵靶基因或者因子,作為重要標志物,用于其臨床診斷、預后判定,對患者的生存率提高、預后改善至關重要。整合素連接激酶(intergrin-linked kinase,ILK)作為59 kDa細胞中一個信號蛋白,其主要作用為催化蛋白質激酶B以及糖原合成酶激酶-3,相關研究表明[2]ILK與結腸癌、前列腺癌、乳腺癌相關緊密。P16是一種具有多種腫瘤抑制作用的腫瘤抑制基因,其中P16的缺失與變異的比例高達75%[3]。細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)是一種特殊的細胞周期調控因子,其在多種癌癥中呈現高表達?，F階段有關ILK、P16、Cyclin D1與膀胱癌之間關系的研究尚不多見[4]。本研究采用細胞免疫組化SP法檢測ILK、P16、Cyclin D1在膀胱癌及正常組織中的水平差異,為下一步深入了解腫瘤發生機制、診斷和評價預后提高參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2020年5月-2022年5月行手術切除的80例膀胱癌組織標本作為膀胱癌組,納入標準:術后均經病理證實為原發性膀胱癌;所有研究對象均已簽署知情同意書。排除標準:有放化療史;合并其他惡性腫瘤;膀胱炎等其他可影響實驗結果的疾病。膀胱癌組男56例,女24例;年齡44～72歲,平均(56.74±6.21)歲;分化程度:高分化34例,中分化26例,低分化20例。另收集80例正常膀胱組織標本作為正常組織組。正常組男58例,女22例;年齡41～74歲,平均(56.69±6.25)歲。兩組在性別、年齡比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。

1.2方法①試劑:福州邁新科技發展有限公司供應的鼠抗人P16單抗;博奧森公司購買家兔抗人ILK多克隆抗體、免疫組化和DAB染色試劑盒;福州邁新科技發展有限公司的兔抗人Cyclin D1。②免疫組化:采用10%甲醇溶液將標本進行固定,以2cm×2cm×2cm的體積塊狀組織進行研究,采用傳統的石蠟包埋;采用乳酸對載玻片進行處理,然后將組織切片為薄片(4μm),粘貼在經過處理的載玻片上,50℃烤箱中烘烤6～10h。對烘烤后的組織予以脫蠟處理,使用醫用微波爐抗原修補3min;以0.2%的胰蛋白酶和3%的雙氧水封閉發酵10min。用PBS溶液5min一次清洗3次;在山羊正常血清滴加之后將其置入37℃水浴箱10min。將殘余的液體甩干后,分別加入ILK、P16和Cyclin D1的抗體,再以PBS緩沖劑和正常山羊血清作為對照,在4℃條件下保存12h。注入振動裝置(PBS緩沖劑)3次,每次5min;將鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶溶液注入10min后,放置振動裝置(PBS緩沖劑)3次,每次5min。二氨基聯苯胺顯色5min,采用蘇木素行襯染,時間為3min,用鹽酸酒精進行分化,用氨水進行反藍;從低度到高度的酒精脫水,于二甲苯脫干后,用傳統的中性樹脂進行封片。結果評判:陽性:呈棕黃色或棕褐色的顆粒,底色為藍色;添加PBS緩沖劑和正常山羊血清為陰性。在(×200)高倍顯微鏡下,選擇10個視野,其中,陽性細胞的表達量≥10%,即為陽性,在10%以下,即為陰性。

1.3觀察指標①比較膀胱癌組織及正常膀胱組織ILK、P16、Cyclin D1的陽性表達率;②分析膀胱癌組織中ILK、P16、Cyclin D1表達與患者臨床病理特征的關系。

1.4統計學處理運用SPSS 22.0統計學軟件,計數資料用n(%)表示,組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman等級相關分析法,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1ILK、P16、CyclinD1在膀胱癌組織及正常膀胱組織中的表達膀胱癌組織ILK、Cyclin D1陽性表達率顯著高于正常膀胱組織,正常膀胱組織P16陽性表達率顯著高于膀胱癌組織(P<0.05),見表1。

表1 ILK、P16、Cyclin D1在膀胱癌組織及正常膀胱組織中的表達[n=80,n(%)]

2.2ILK、P16、CyclinD1與不同病理分級的關系高分化組織ILK、Cyclin D1陽性表達率顯著低于中低分化組織,高分化組織P16陽性表達率顯著高于中低分化組織(P<0.05),見表2。

表2 ILK、P16、Cyclin D1與不同病理分級的關系[n(%)]

2.3P16與ILK、CyclinD1在膀胱癌中表達的關系經Spearman相關分析顯示,膀胱癌中ILK與P16表達呈負相關(r=-0.274,P<0.05),Cyclin D1與P16表達亦呈負相關(r=-0.375,P<0.05),見表3。

表3 P16與ILK、Cyclin D1在膀胱癌中表達的關系(n=80)

3 討論

膀胱癌是最普遍的泌尿系統惡性腫瘤之一,移行細胞癌約占95%[5-6]。近些年,通過分子生物學的深入探討,發現癌癥的形成是一種多基因、多時期的分子過程,在此過程中,癌細胞被活化、抑制癌癥的基因失活及其相互作用,其表達的蛋白在調節細胞的循環中起著重要作用[7]。

Cyclin D1是一種調控細胞周期的因子,在多種原發腫瘤中呈高水平表達,在預測癌癥方面起著非常關鍵的作用[8]。ILK作為59 kDa細胞中一個信號蛋白,其主要的作用機制為催化蛋白質激酶B以及糖原合成酶激酶-3,而高娟等[2]研究表明ILK與結腸癌、前列腺癌、乳腺癌相關;嚴敏琴等[9]研究顯示,利用siRNA ILK或小分子抑制劑對ILK活性進行抑制,能有效地降低腫瘤細胞的發生發展。本結果顯示,Cyclin D1和ILK在膀胱癌中的表達水平顯著高于正常組織,隨著腫瘤的惡性程度越高,Cyclin D1和ILK的表達也隨之升高。說明Cyclin D1的異常表達是其發生的重要因素。ILK和Cyclin D1可能與膀胱癌的發生、發展具有一定的時空協同效應,提高了腫瘤的侵入性,提示兩者的結合對膀胱癌的診斷和預后判斷有積極作用。

P16基因和已知的p53和Rb基因同是抗腫瘤基因,屬于多腫瘤抑制基因。李苒等[10]研究發現,P16的突變和突變率高達75%,遠高于P53的50%。故而認為P16是腫瘤發生發展中的一個關鍵環節。本研究結果發現:P16在膀胱癌中的表達水平顯著較正常組織低,隨著腫瘤的惡性程度越高,P16的表達也隨之降低;此外,還發現ILK、Cyclin D1表達和P16表達呈顯著負相關。故認為,P16低水平導致ILK和Cyclin D1的水平升高,協同參與了膀胱癌的發生和發展。因此,結合三項指標對評價腫瘤的分級和預后具有一定的參考價值。

綜上所述,ILK、Cyclin D1在膀胱癌中均呈過高表達,P16在膀胱癌中均呈過低表達,同時和病理分化程度緊密相關,提示其參與膀胱癌的發生發展,可作為評估腫瘤病理學分期的相關依據,其綜合應用對膀胱癌的診斷和預后具有一定的指導意義。