基于代謝組學分析郁李仁苷A 對小鼠糞便代謝物的影響

趙錦江，趙梓邯，張羽師，張曉冰，劉舒鵬，王笑雪，李衛東

（北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488）

關鍵字：郁李仁苷A；代謝組學；糞便代謝物；瀉下

便秘在全球都有較高的發病率[1]，對人的精神、心理以及生活質量均會造成不良的影響[2]。臨床上治療便秘的藥物以促分泌素類藥物如利那洛肽，膳食纖維補充劑如粗纖維飲食，刺激性瀉藥如番瀉葉苷，滲透性瀉藥如聚乙二醇，促運動藥如莫沙必利等為代表，但是上述藥物治療效果不理想，且副作用較大[3-4]。

郁李仁是一味傳統的潤下類中藥，具有兩千多年的藥用歷史。課題組前期的研究表明，郁李仁瀉下的特效成分為郁李仁苷A，該化合物是一種黃酮類成分[5-6]，但其瀉下機制仍不清楚，代謝組學可能是闡述其瀉下機制的重要途徑。代謝組學通過檢測機體受到干擾后內源性代謝物的變化，從中找出與干擾相關的差異代謝物，同時結合生物信息學分析闡明代謝通路，繼而解析生物代謝機制[7]，可用于輔助疾病的早期診斷以及疾病機制、藥物作用機制、靶點發現、毒效和毒理機制等方面的研究[8]。

本研究基于代謝組學技術方法，對給予郁李仁苷A 后的小鼠糞便代謝物進行分析，旨在探討郁李仁苷A 對于小鼠代謝的影響，分析其參與瀉下的可能機制，為后續相關研究提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DW-HL528 型超低溫冰箱（中國中科美菱低溫科技有限公司）；FD-2A 型冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；UPLC 級色譜柱（美國Waters AQUITY UPLC HSS T3 色譜柱，2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm ）；DIONEX Ultimate 3000 型UPLC 超高效液相色譜儀、UPLC-Q-Exactive Oribitrap MS 線性離子阱四極軌道質譜、Sorall ST 8R 型高速冷凍離心機，均購于美國賽默飛科技公司。

郁李仁苷A（純度＞95%）為實驗室自制；乙腈、甲醇、甲酸均為質譜級，購自美國賽默飛科技公司；L-2-氯苯丙氨酸（分析標準品，HPLC ≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 實驗動物及分組

雄性ICR 小鼠，體質量為24 ～ 26 g，購自斯貝福（北京）生物科技有限公司。小鼠隨機分3 組（n= 10），分別是空白對照組（C 組）、給藥組（M 組）、恢復組（R 組）。實驗前所有小鼠均于北京中醫藥大學實驗動物中心適應性飼養1 周，期間自由飲水，并給予標準飲食。室溫為（22±2）℃，濕度為（60±5）%，每日光照12 h。實驗方案經北京中醫藥大學動物倫理委員會審核通過。適應性飼養待小鼠狀態穩定后，M組和R 組連續3 d 經口灌胃給予受試物20 mg/kg，C組給予生理鹽水，每日一次，首次給藥前16 h 禁食不禁水，而后自由飲食，給藥體積10 mL/kg。其中，R 組的小鼠連續3 d 給藥結束繼續正常飼養48 h 后取材，其他兩組均在第三次給藥后2 h 取材。

1.3 糞便樣本預處理方法

處死小鼠后，取盲腸內容物500 mg 于干凈的離心管中，液氮速凍，-80℃保存備用。將盲腸內容物冷凍干燥，充分混勻后，稱取20 mg 盲腸內容物干燥粉末，加入400 μL 的80%甲醇水溶液（內含20 μg/mL 的L-2-氯苯丙氨酸作為內標），充分震蕩提取，12 000 r/min 離心10 min，前后兩次，移取上清液，用于LC-MS 檢測。移取每個樣品的上清液20 μL 合并，作為質量控制樣品用于評價儀器和方法穩定性。

1.4 糞便代謝組學條件

柱溫為35 ℃，樣品室溫度為4 ℃，流速為 0.25 mL/min，進樣量為 3 μL。流動相A 為0.1%甲酸-水，流動相B 為乙腈。梯度洗脫：0 ～ 5 min ，8% →40%B；5 ～ 10 min，40%→ 60% B；10 ～ 15 min，60%→95%B；15 ～ 16 min，95% → 95%B。質譜條件為正、負離子模式，HESI 離子源，離子源溫度為350 ℃，電離源電壓為3.0 kV，毛細管電壓為-35 V，管透鏡電壓為-110 V，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣（純度 ＞99.99%），鞘氣流速為35 arb，輔助氣流速為10 arb。一級全掃描（Full Scan,m/z60 ～ 1 000）；數據依賴性二級質譜掃描ddMS2，碰撞能20 、40 、60 eV[9-10]。

1.5 數據預處理與分析

得到各樣本的RAW 格式原始數據，借助Thermo Scientific Xcalibur 2.2、Compound Discoverer 3.0 和Mzmine 2.53 軟件進行一級和二級質譜數據處理和分析。在所有QC 樣本中，各特征峰的保留時間差不超過0.1 min，峰強的相對標準偏差（RSD）不超過20%。以內標物峰強為參考對各信號峰的峰強進行標準化處理，以進一步排除儀器及方法穩定性可能帶來的數據誤差。隨后將含有質荷比（m/z）、保留時間（RT）和峰強度的數據導出進行下一步的分析。通過準確的質荷比（m/z）和二級質譜（ms/ms）信息，使用compound discover（v3.0）軟件進行代謝物的鑒定，并通過HMDB 5.0（https://hmdb.ca/）進行進一步的驗證。

將原始數據通過metaboanalyst 5.0（https://www.metaboanalyst.ca/）數據庫進行處理。將處理得到的數據進行下一步的多元統計分析，包括主成分分析（ PCA）和正交偏最小二乘判別分析 （OPLS-DA）。OPLS-DA 模式進一步評估空白對照組和給藥組小鼠糞便的代謝差異，并篩選重要的差異代謝物。OPLSDA 的差異權重貢獻值（VIP）評分識別主要的差異代謝物，并與t檢驗和FC 值進行相互驗證，通過VIP ＞1、P＜0.05 及|log2（FC）| ＞1 的 參 數 來 篩 選 重要的差異代謝物。將得到的重要差異代謝物通過metaboanalyst5.0（https://www.metaboanalyst.ca/）數據庫進行代謝途徑分析。

1.6 統計學方法

采用Graphpad Prism9.0 統計學軟件進行處理。計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 郁李仁苷A 對正常小鼠的代謝模式的影響

首先，QC 樣本在PCA 圖中聚集集中，見圖1，表明分析過程中儀器和方法具有良好的重復性、穩定性和可靠性，可用于代謝分析?；鍙姸壬V圖如圖2 所示。在正、負離子模式下的PCA 圖，M 組、R 組和C 組都有明顯的分離，其中R 組的聚集相較于給藥組更為集中，說明給藥后不同小鼠代謝的個體差異較為顯著，但是在恢復后各個小鼠的代謝水平又會變得較為一致，同時R組和C組之間的分離仍然明顯。隨后，通過OPLS-DA 進行進一步的分析，同時進行兩組之間的t檢驗，篩選重要的差異代謝物，并進行鑒定。選擇VIP ＞1、P＜0.05 及|log2（FC）|＞1 的代謝物進行通路富集分析。使用火山圖顯示差異代謝物的信息，見圖3。

圖1 小鼠糞便代謝物物的PCA 分析圖Fig 1 PCA analysis of mouse fecal metabolites

圖2 小鼠糞便代謝物物的正、負離子模式下的基峰譜圖Fig.2 Base peak spectra of mouse fecal metabolites in positive mode and negative mode

圖3 小鼠糞便代謝模式的火山圖Fig 3.Mouse fecal metabolic pattern volcano plot

2.2 郁李仁苷A 給藥后小鼠糞便中的差異代謝物分析

通過上述代謝物的篩選標準，從R 組中共篩選到46 個差異代謝物（表1），在M 組中共篩選到38個差異代謝物（表2）。這些差異代謝物有脂肪酸、膽汁酸、氨基酸、?；撬?、乳糖、磷酸類、嘧啶等，其中，影響較為明顯的是氨基酸、脂肪酸、?；撬?、膽汁酸和糖類。

表1 M 組與C 組的差異代謝物Tab 1.Differential metabolites between M group and C group

表2 R 組與C 組的差異代謝物Tab.2 Differential metabolites between the R group and C group

通過對上述差異代謝物的log2（FC）進行分析發現，在M 組中的差異代謝物以上調趨勢較為明顯（圖4、5），主要有乳酸、尿氨酸、丙酸、草酸、甲羥戊酸、丙烯酸等。R 組則以下調居多，主要是胞嘧啶、肌苷、甾膽素、尿膽素原、腎上腺酸、5-羥基、乙酸、甲基琥珀酸、脫氧膽酸、尿苷等代謝物。上調差異代謝物大多屬于短鏈脂肪酸（SCFAs），而SCFAs 具有較為顯著的免疫調節潛能和促進腸道蠕動作用[11]。

圖4 M 組差異代謝物的上調與下調圖Fig 4 Upregulation and downregulation plot of differential metabolites in the administration group (M group)

圖5 R 組差異代謝物的上調與下調圖Fig 5.Upregulation and downregulation plot of differential metabolites in the recovery group (R group)

2.3 郁李仁苷A 給藥后小鼠糞便中的代謝通路分析

通過進一步對上述差異代謝物進行KEGG 通路分析（圖6）和KEGG 富集分析（圖7），發現在M組中影響較為顯著的通路有亞油酸代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、苯丙氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、半乳糖代謝、?；撬岷痛闻；撬岽x、嘧啶代謝。而在R 組中仍然存在顯著影響的通路主要是?；撬岷痛闻；撬岽x。其他影響較低的代謝通路如淀粉和蔗糖代謝、膽汁酸生物合成等，在R 組和M 組均存在。

圖6 M 組小鼠糞便代謝物通路分析圖Fig.6 Analysis plot of fecal metabolite pathways in mice of M group

圖7 小鼠糞便代謝物差異代謝物的富集分析圖(M 組)Fig.7 Enrichment analysis plot of differential metabolites in mouse Fecal metabolites（M group）

3 討論

本研究發現，郁李仁苷A 參與苯丙氨酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，以及精氨酸和脯氨酸代謝等多條氨基酸代謝通路。腸道氨基酸代謝具有重要的生理和營養功能，可以為腸蠕動提供能量，為腸黏膜細胞和腸腔內微生物合成蛋白質、氨基酸、谷胱甘肽、多胺、嘌呤和嘧啶核苷供給氮源和碳骨架，還可以維持腸黏膜細胞的數量及其吸收、防御、細菌屏障和免疫功能，調節腸腔內微生物種群的多樣性和活性等[12]。因此，郁李仁苷A 可以通過調控氨基酸代謝通路為腸道細胞提供營養、促進腸道黏液分泌、改善腸道屏障、調節腸道免疫、促進腸道吸收、保護腸道細胞，并為腸道蠕動提供能量來保證腸道發揮正常的生理功能，進而維持排便的正常。

同時，本研究還發現郁李仁苷A 可以參與到丙酮酸代謝、嘧啶代謝和?；撬岷痛闻；撬岽x等多條代謝途徑，通過影響上述代謝途徑調節機體狀態。其中，丙酮酸代謝是能量代謝的一個重要組成，腸道蠕動需要大量的能量供給，因此，提高腸道組織的能量代謝對于便秘的治療具有重要的意義[13]。此外，嘧啶代謝對于炎癥狀態具有一定的指示作用，有研究表明便秘小鼠結腸組織嘧啶代謝相關的胸苷和脫氧胞苷均處于異常狀態，提示小鼠結腸組織嘧啶代謝處于紊亂狀態，這會引起便秘小鼠腸道炎癥，導致腸道功能障礙[14]。因此郁李仁苷A 對嘧啶代謝通路的影響可能是緩解便秘引起的一系列腸道炎癥的機制。大量的研究證實?；撬峋哂性S多生理功能，如抗氧化、抗炎等[15-16]。同時，研究表明便秘產生的過量自由基會進加劇機體氧化損傷，影響腸道功能，故抗氧化在改善便秘相關疾病的治療中發揮著重要作用[17]。而郁李仁苷A 影響?；撬岽x可能是其發揮抗氧化作用，從而保護腸道健康的一個機制。綜上所述，郁李仁苷A 給藥后可以調控上述代謝通路進而參與能量代謝、抗炎抗氧化、免疫調節等保障腸道正常生理功能。

4 結論

研究表明郁李仁苷A 對于小鼠腸道代謝的影響是多方面的，其作用可能有助于恢復腸道平衡和穩態，對于便秘引起的各種腸道功能紊亂可能具有調節功能。但作為對郁李仁苷A 作用機制的初步探索，代謝組學的研究還需要進一步的實驗驗證，后續將繼續對郁李仁苷A 的相關機制作深入的研究。