硫酸銅、敵百蟲、聚維酮碘對吉富羅非魚的急性毒性及組織病理學研究

戴瑜來，王宇希，許寶青，戴楊鑫，林啟存，蔡麗娟

杭州市農業科學研究院，浙江 杭州 310024

羅非魚隸屬于鱸形目、麗魚科、羅非魚屬，是聯合國糧農組織 (Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO) 向全世界推廣養殖的優質魚類之一。其中，吉富羅非魚 (GIFT tilapia,Oreochromisniloticus) 因生長速度快、抗逆性強、出肉率高，深受水產從業者喜愛，是目前我國主要的羅非魚養殖品種之一[1-3]。

隨著羅非魚養殖產業的不斷發展，高密度、集約化養殖增加了羅非魚疾病的發生率。湖病毒病[4]、鏈球菌病[5]、氣單胞菌病[6]、柱狀黃桿菌病[7]、黏孢子蟲病[8]、上皮囊腫病[9]、黑斑病[10]、車輪蟲病[11]等的不斷發生，嚴重威脅著養殖羅非魚的健康。然而，國內外針對羅非魚 (尤其是苗種)藥物敏感性的研究卻鮮有報道，若按照藥物的常用濃度給藥存在較大風險。以不合理的濃度連續用藥會引發新的問題，導致藥物殘留、病原菌耐藥性增強并影響水產品安全性，甚至威脅到環境安全和人類健康[12]。

敵百蟲、硫酸銅、聚維酮碘是目前水產養殖領域廣泛使用的寄生蟲藥或水體殺菌消毒劑，其過量使用可導致水產動物組織發生不利改變[13-15]。目前有關敵百蟲、硫酸銅、聚維酮碘對羅非魚組織病理學的毒害作用報道較少。組織病理學研究可直觀發現急性藥物中毒過程中魚體的組織形態學變化，了解藥物對魚體的主要損傷部位，有助于分析藥物的毒害作用[16]。羅非魚組織病理學的進一步改變會導致魚體行為異常，出現臨床癥狀。為了解水產上常用藥物敵百蟲、硫酸銅、聚維酮碘的合理給藥劑量及安全性，評估其對吉富羅非魚的毒害作用，本研究以吉富羅非魚為試驗對象，從組織-細胞水平分析藥物對試驗魚的急性毒性、藥物暴露下魚的行為變化和組織病理學，探究科學的給藥劑量，旨在提高藥物療效，減少藥物浪費和環境污染。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本試驗所用吉富羅非魚采自杭州市農業科學研究院水產研究所，全長 (4.00±0.31) cm、體長(3.10±0.37) cm、體質量 (0.89±0.22) g。隨機挑選體格健康、大小均勻、體表無損的吉富羅非魚作為試驗對象。試驗前，將幼魚暫養于實驗室的玻璃缸中，暫養時間為2 周，正常投飼，待其適應實驗室環境后開始試驗。

1.2 實驗藥品

硫酸銅 (CuSO4·5H2O，純度99.0%，國藥集團化學試劑有限公司)；敵百蟲 (w≥90%，南通江山農業化工股份有限公司)；聚維酮碘 (w≥99%，國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3 急性毒性試驗條件

試驗在規格為長96.5 cm×寬47.5 cm×高49.0 cm 的玻璃缸中進行，每缸水體150 L，試驗用水為經存放并曝氣處理24 h 的自來水，每缸投放實驗魚30 尾，各備有一個充氣頭，試驗時pH 為7.58～7.83、溶解氧為7.35～8.16 mg?L-1、水溫為22.5～24.5 ℃，光照采用自然光。

1.4 急性毒性試驗方法

本研究采用靜態急性毒性試驗法[17]。試驗前通過預試驗確定試驗濃度范圍，試驗設置5 個濃度梯度 (I—V，表1)，濃度梯度按照等對數間距設置，同時設2 個平行組及1 個對照組 (對照組為不含藥物的曝氣自來水)。試驗藥物需先配成高濃度的母液，再按要求潑灑添加，藥液均為現配現用。用藥后前8 h 內連續觀察魚的中毒癥狀和死亡情況，8 h 后按用藥開始的第24、第48 和第96 小時記錄魚的死亡數目，期間及時撈除死亡個體 (以喪失游泳能力，觸碰無反應為準)。試驗前24 h 作停飼處理，且以對照組死魚不超過5%為本試驗進行的必要條件。

表1 用藥濃度Table 1 Concentrations of test drugs

1.5 組織病理學觀察

進行急性毒性試驗48 h 后，分別從每種藥物的試驗組 (含2 個平行組，選取活力差或瀕臨死亡的試驗魚) 和對照組各取3 尾魚樣用于組織病理學分析。

光鏡觀察：用MS-222 麻醉后，進行活體解剖，分別取對照組和試驗組 (暴露于表1 藥物濃度IV) 的鰓、肝臟、腎臟、腦組織，經1×PBS 漂洗后，Bouin 氏液固定，常規脫水，石蠟包埋切片，HE 染色，在OLYMPUS 顯微鏡下觀察并拍照保存。

透射電鏡觀察：按照常規方法進行制作，將對照組和試驗組 (暴露于表1 的藥物濃度IV) 的鰓、肝、腎、腦組織于活體狀態迅速取下，1×PBS 漂洗后分割成小于1 mm3的小塊，經戊二醛-鋨酸雙固定，4 ℃冰箱保存，乙醇脫水，環氧樹脂Epon812 包埋，RMC-XL 超薄機超薄切片，醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染法染色，用日立7650 型透射電鏡觀察并拍照保存。

1.6 半致死濃度和安全濃度的計算

根據第24、第48 和第96 小時不同藥物、濃度條件下受試魚的死亡率，采用改進寇氏法[18]，計算上述時間的半致死濃度 (LC50)和安全濃度 (SC)：

式中：CLC50為半致死濃度，CLC50的95%置信區間= lg-1(lgCLC50±1.96SE·lgCLC50)；Xmax為試驗組最大劑量的對數；a為相鄰組濃度對數之差；SE為標準誤差；pi為各組的死亡率；∑pi為各組死亡率的總和；n為每組動物數；CS為安全濃度，根據24和48 h 的LC50求得。

1.7 數據處理

記錄每組試驗魚的死亡數量，取平均值后換算成死亡率，用Microsoft Excel 2010 軟件進行處理，計算出24、48、96 h 的半致死濃度及安全濃度。

2 結果

2.1 硫酸銅對吉富羅非魚生態行為的影響

將硫酸銅母液按濃度要求稀釋后潑灑進入裝有吉富羅非魚魚苗的玻璃缸中，各缸中的魚起初未見明顯反應，高濃度組 (8.435 和15 mg?L-1) 有6.67%的魚出現體表黏液增多現象；試驗進行6 h后，最高濃度組 (15 mg?L-1) 有魚出現中毒癥狀，魚體側翻游動，時而亂竄、時而沉底，對外部刺激不敏感；12 h 后最高濃度組開始出現死亡，死魚體表和魚鰓發白且有黏液附著，其余無殊。硫酸銅對吉富羅非魚的24、48 和96 h 的LC50分別為13.715、10.351 和5.896 mg?L-1，SC 為1.769 mg?L-1(表2)。

表2 硫酸銅對吉富羅非魚的毒性試驗結果Table 2 Toxicity test results of copper sulfate on GIFT tilapia

2.2 敵百蟲對吉富羅非魚生態行為的影響

敵百蟲母液按濃度要求稀釋后潑灑進入裝有吉富羅非魚魚苗的玻璃缸后，其初始情況與硫酸銅組差異不大，在實驗進行8 h 后才出現中毒癥狀，魚中毒后浮于水面竄游，側翻游動，平衡能力減弱，有2.22%的魚出現抽搐現象；10 h 后，最高濃度組 (40 mg?L-1) 開始出現死魚，身體僵直，體色變黑，鰓蓋和口部張開；72 h 后，可見高濃度組(28.284 和40 mg?L-1) 有將近10%的魚出現畸形游動現象，表現為脊椎彎曲。敵百蟲對吉富羅非魚的24、48 和96 h 的LC50分別為43.036、25.887和16.689 mg?L-1，SC 為2.810 mg?L-1(表3)。

表3 敵百蟲對吉富羅非魚的毒性試驗結果Table 3 Toxicity test results of trichlorfon on GIFT tilapia

2.3 聚維酮碘對吉富羅非魚生態行為的影響

將聚維酮碘母液按濃度要求潑灑進入玻璃缸中，其初始情況較敵百蟲、硫酸銅組差異較大，在實驗進行45 min 后，最高濃度組 (30 mg?L-1) 開始出現中毒癥狀，表現出群體浮頭現象，有將近30%的魚沉底或旋轉亂竄；1 h 后，最高濃度組開始出現死魚，魚鰓發紫，體表無明顯癥狀。聚維酮碘對吉富羅非魚的24、48 和96 h 的LC50分別為10.509、9.301 和8.674 mg?L-1，SC 為2.190 mg?L-1(表4)。

表4 聚維酮碘對吉富羅非魚的毒性試驗結果Table 4 Toxicity test results of povidone-iodine on GIFT tilapia

2.4 組織病理學結果

藥物影響下吉富羅非魚鰓組織的變化見圖1，與對照組 (圖1-a) 相比，8.435 mg?L-1硫酸銅處理組鰓組織損害明顯，鰓絲輪廓模糊不清，上皮細胞腫脹 (圖1-b)；28.284 mg?L-1敵百蟲處理組鰓組織間隙變大，鰓絲及組織破壞嚴重 (圖1-c)；16.870 mg?L-1聚維酮碘處理組鰓絲萎縮，上皮組織增生(圖1-d)。

圖1 不同藥物作用下鰓組織的變化注：a.對照組；b.8.435 mg?L-1 硫酸銅處理組；c.28.284 mg?L-1 敵百蟲處理組；d.16.870 mg?L-1 聚維酮碘處理組。Fig.1 Changes of gill by different drugsNote: a.Control group; b.8.435 mg?L-1 copper sulfate treatment; c.28.284 mg?L-1 trichlorfon treatment; d.16.870 mg?L-1 povidone-iodine treatment.

藥物影響下吉富羅非魚肝組織的變化見圖2，與對照組 (圖2-a) 相比，8.435 mg?L-1硫酸銅處理組肝組織間空隙變大，細胞核萎縮 (圖2-b)；28.284 mg?L-1敵百蟲處理組出現大量無核肝細胞，且組織間結構呈不規則形態 (圖2-c)；16.870 mg?L-1聚維酮碘處理組肝組織空泡化且存在充血現象 (圖2-d)。

圖2 不同藥物作用下肝組織的變化注：a.對照組；b.8.435 mg?L-1 硫酸銅處理組；c.28.284 mg?L-1 敵百蟲處理組；d.16.870 mg?L-1 聚維酮碘處理組。Fig.2 Changes of liver by different drugsNote: a.Control group; b.8.435 mg?L-1 copper sulfate treatment; c.28.284 mg?L-1 trichlorfon treatment; d.16.870 mg?L-1 povidone-iodine treatment.

藥物對吉富羅非魚腦組織的影響見圖3，與對照組 (圖3-a) 相比，8.435 mg?L-1硫酸銅處理組中可見腦組織神經纖維出現輕微破損，細胞出現破裂現象 (圖3-b)；28.284 mg?L-1敵百蟲處理組腦組織神經纖維破損及細胞破裂明顯 (圖3-c)；16.870 mg?L-1聚維酮碘處理組除神經纖維有輕微破損外，未見其他明顯變化 (圖3-d)。

圖3 不同藥物作用下腦組織的變化注：a.對照組；b.8.435 mg?L-1 硫酸銅處理組；c.28.284 mg?L-1 敵百蟲處理組；d.16.870 mg?L-1 聚維酮碘處理組。Fig.3 Changes of brain by different drugsNote: a.Control group; b.8.435 mg?L-1 copper sulfate treatment; c.28.284 mg?L-1 trichlorfon treatment; d.16.870 mg?L-1 povidone-iodine treatment.

藥物對吉富羅非魚腎組織影響見圖4，與對照組(圖4-a) 相比，8.435 mg?L-1硫酸銅處理組中組織間隙變大，腎小管壞死 (圖4-b)；28.284 mg?L-1敵百蟲處理組中可見結構排列松散，腎間質出血現象(圖4-c)；16.870 mg?L-1聚維酮碘處理組中除結構排列松散外，未見其他明顯差異 (圖4-d)。

圖4 不同藥物作用下腎組織的變化注：a.對照組；b.8.435 mg?L-1 硫酸銅處理組；c.28.284 mg?L-1 敵百蟲處理組；d.16.870 mg?L-1 聚維酮碘處理組。Fig.4 Changes of kidney by different drugsNote: a.Control group; b.8.435 mg?L-1 copper sulfate treatment; c.28.284 mg?L-1 trichlorfon treatment; d.16.870 mg?L-1 povidone-iodine treatment.

透射電鏡下，藥物對吉富羅非魚鰓組織影響見圖5，與對照組 (圖5-a) 相比，8.435 mg?L-1硫酸銅處理組鰓組織出現空泡化，組織間間隙變大 (圖5-b)；28.284 mg?L-1敵百蟲處理組中細胞邊界不清，細胞發生凋亡 (圖5-c)；16.870 mg?L-1聚維酮碘處理組中線粒體數增多，線粒體雙層膜結構不完整(圖5-d)。

圖5 不同藥物作用下鰓組織的變化 (透射電鏡)注：a.對照組 (15 000×)；b.8.435 mg?L-1 硫酸銅處理組 (8 000×)；c.28.284 mg?L-1 敵百蟲處理組 (8 000×)；d.16.870 mg?L-1聚維酮碘處理組 (15 000×)。Fig.5 Changes of gill by different drugs (TEM)Note: a.Control group (15 000×); b.8.435 mg?L-1 copper sulfate treatment (8 000×); c.28.284 mg?L-1 trichlorfon treatment (8 000×);d.16.870 mg?L-1 povidone-iodine treatment (15 000×).

透射電鏡下，藥物對吉富羅非魚肝組織的影響見圖6，與對照組 (圖6-a) 相比，8.435 mg?L-1硫酸銅處理組肝組織空泡化，細胞核固縮 (圖6-b)；28.284 mg?L-1敵百蟲處理組線粒體腫脹，嵴斷裂，并呈空泡化 (圖6-c)；16.870 mg?L-1聚維酮碘處理組中細胞出現凋亡現象，有髓樣小體出現 (圖6-d)。

圖6 不同藥物作用下肝組織的變化 (透射電鏡)注：a.對照組 (8 000×)；b.8.435 mg?L-1 硫酸銅處理組 (7 000×)；c.28.284 mg?L-1 敵百蟲處理組 (25 000×)；d.16.870 mg?L-1聚維酮碘處理組 (10 000×)。Fig.6 Changes of liver by different drugs (TEM)Note:a.Control group (8 000×); b.8.435 mg?L-1 copper sulfate treatment (7 000×); c.28.284 mg?L-1 trichlorfon treatment (25 000×); d.16.870 mg?L-1 povidone-iodine treatment (10 000×).

透射電鏡下，藥物對吉富羅非魚腦組織的影響見圖7，與對照組 (圖7-a) 相比，8.435 mg?L-1硫酸銅處理組可見細胞邊界不清，細胞發生凋亡 (圖7-b)；28.284 mg?L-1敵百蟲處理組細胞核固縮 (圖7-c)；16.870 mg?L-1聚維酮碘處理組有明顯變化 (圖7-d)。

圖7 不同藥物作用下腦組織的變化 (透射電鏡)注：a.對照組 (10 000×)；b.8.435 mg?L-1 硫酸銅處理組 (8 000×)；c.28.284 mg?L-1 敵百蟲處理組 (8 000×)；d.16.870 mg?L-1聚維酮碘處理組 (8 000×)。Fig.7 Changes of brain by different drugs (TEM)Note: a.Control group (10 000×); b.8.435 mg?L-1 copper sulfate treatment (8 000×); c.28.284 mg?L-1 trichlorfon treatment (8 000×);d.16.870 mg?L-1 povidone-iodine treatment (8 000×).

透射電鏡下，藥物對吉富羅非魚腎組織的影響見圖8，與對照組 (圖8-a)相比，8.435 mg?L-1硫酸銅處理組中組織間間隙變大，核膜破損 (圖8-b)；28.284 mg?L-1敵百蟲處理組中除線粒體形態變化外，未見其他明顯差異 (圖8-c)；16.870 mg?L-1聚維酮碘處理組中除線粒體腫脹、形態變化外，未見其他明顯差異 (圖8-d)。

圖8 不同藥物作用下腎組織的變化 (投射電鏡)注：a.對照組 (8 000×)；b.8.435 mg?L-1 硫酸銅處理組 (8 000×)；c.28.284 mg?L-1 敵百蟲處理組 (10 000×)；d.16.870 mg?L-1 聚維酮碘處理組 (10 000×)。Fig.8 Changes of kidney by different drugs (TEM)Note: a.Control group (8 000×); b.8.435 mg?L-1 copper sulfate treatment (8 000×); c.28.284 mg?L-1 trichlorfon treatment (10 000×);d.16.870 mg?L-1 povidone-iodine treatment (10 000×).

3 討論

3.1 3 種漁藥引起的組織病理學變化

硫酸銅作為水產養殖水體中銅離子 (Cu2+) 的來源之一，通過在生物體內蓄積，當其含量達到一定濃度時，會引起一系列中毒反應，如行為異常、組織病變或可能造成死亡[19-20]。本研究中，高濃度硫酸銅會引起吉富羅非魚魚苗側翻、亂竄、沉底等急性中毒現象，且造成一系列的組織病理變化，最終導致死亡。有研究表明魚鰓是吸收Cu2+的主要部位，Cu2+進入魚體后通過生化反應和血液運輸至機體其他部位，造成各組織損傷[21]。Jooyandeh 等[22]發現，15 mg?L-1硫酸銅能引起草魚 (Ctenopharyn-godonidella) 鰓組織發生包括板層壞死、增生、板層粘連、出血、鰓板棒狀等組織病理學變化；胡亞東[23]將暗紋東方鲀 (Takifuguobscurus) 暴露于含100 μg?L-1Cu2+的環境中，造成其鰓絲畸形，出現動脈瘤和壞死，肝臟細胞核固縮和炎性損傷、壞死；馬莉芳[24]研究水體Cu2+對黃河鯉 (Cyprinus carpio) 的毒性時發現，2.51 mg?L-1的Cu2+會導致黃河鯉鰓絲腫脹、肝細胞壞死、腎小管上皮細胞變形崩解。

敵百蟲是乙酰膽堿酯酶的有效抑制劑，已發現對眾多水生生物有毒害作用[25]。有研究表明，魚類可經食道、呼吸系統及皮膚接觸吸收過量的敵百蟲而導致中毒[26]；長期接觸低濃度的敵百蟲也會抑制魚體內膽堿脂酶的活性，導致其行為、代謝和激素變化，損害肝、腎及體內細胞的遺傳物質[27-28]。本研究中的吉富羅非魚魚苗暴露在敵百蟲環境下，出現多種異常行為，組織結構也發生諸多不利變化。已有研究發現，尼羅羅非魚 (O.niloticus) 暴露于0.5 mg?L-1敵百蟲環境下會造成異常游泳行為和不良生理反應[28]；敵百蟲暴露會造成鯉神經毒性、肝臟脂質過氧化并改變頭部腎臟和脾臟結構[29]；敵百蟲可誘導異育銀鯽 (Carassiusauratusgibelio) 肝細胞凋亡，導致線粒體空泡化、細胞質丟失和核固縮[13,30]；均與本研究結果基本一致。此外，長期接觸敵百蟲可破壞鯉腸道免疫功能，引起腸道炎癥，造成腸道損傷[31]。

目前，國內外關于聚維酮碘對魚類組織病理學的研究相對較少。Hedayati 等[15]研究發現，聚維酮碘高于5 mg?L-1時可造成鯉的鰓絲彎曲、繼發性黏連、出血，肝細胞破壞、凋亡，聚維酮碘對鰓的損傷程度要大于肝臟，與本研究結果相似。

3.2 3 種漁藥的用藥注意事項

硫酸銅在生產上主要用于殺滅中華鳋 (Sinergasilus)、車輪蟲 (Trichodina)、斜管蟲 (Chilodonella)、舌杯蟲 (Apiosomaspp.)、水網藻 (Hydrodictyaceae)、青苔 (Chlorella) 等。本研究中硫酸銅用藥的結果明顯高于尼羅羅非魚[規格 (3.3±0.3) cm、(1.5±0.2) g，96 h 的LC50為1.093 mg?L-1][32]，但遠低于同為鱸形目的攀鱸 [Anabastestudineus，規格(7.9±0.4) cm、(7.8±1.6) g，SC 為7.010 mg?L-1][33]。然而，較硫酸銅的常用濃度 (表5)，其對本研究規格的吉富羅非魚而言是一種較為安全的藥物。

表5 3 種藥物常用質量濃度與安全濃度對比Table 5 Comparison of common mass concentration and safe concentrations of three drugs

敵百蟲是一種廣譜性有機磷類殺蟲劑，主要用于殺滅體表的中華鳋、魚鲺(Argulussp.)、錨頭鳋(Lernaea)、指環蟲 (Dactylogyridae)、三代蟲 (Gyrodactylus) 等。本實驗敵百蟲用藥的結果遠大于奧尼羅非魚 (O.niloticus♀×O.aureus♂，規格2.8～3.0 cm、0.48～0.50 g，96 h 的LC50為1.57 mg?L-1，SC 為0.157 mg?L-1)[26]和同目的黑鯛 [Sparusmacrocephlus，規格(13.0±0.4) g，96 h LC50為0.54 mg?L-1，SC 為0.14 mg?L-1][34]、梭鱸 (Luciopercaluciopeica，規格2.9～3.4 cm、0.25 g，96 h LC50為2.13 mg?L-1，SC為0.213 mg?L-1)[35]。較表5 的常用濃度，敵百蟲對于本研究規格的吉富羅非魚也較安全。

聚維酮碘是聚乙烯吡咯烷酮與碘的絡合物，對大部分細菌、真菌、霉菌孢子及部分病毒均有一定的殺滅作用。試驗中聚維酮碘用藥的結果極接近于不同規格的吉富羅非魚[規格(10.12±0.83) cm、(17.14±1.77) g，96 h 的LC50為7.95 mg?L-1][36]，低于同為鱸形目的藍點笛鯛 [Lutjanusrivulatus，規格(2.45±0.10) cm、(0.425±0.010) g，SC 為2.842 9 mg?L-1][37]和梭魚 [Planilizahaematocheila，規格(4.22±0.87) cm、(1.23±0.28) g，SC 為4.7 mg?L-1][38]，其安全濃度高于常用濃度 (表5)，因此，聚維酮碘對于本研究規格吉富羅非魚可按常用劑量安全使用。

本研究表明，硫酸銅、敵百蟲、聚維酮碘對于本實驗規格的吉富羅非魚均為較為安全的藥物。然而，從組織病理學研究發現，在高濃度藥物暴露下，魚的組織 (細胞器) 均有不同程度的損害，且可能造成不可逆后果，從而影響魚的生長、發育，或直接導致死亡。此外，藥物的使用還需結合養殖動物所處的養殖周期及環境，不同養殖周期的水產動物對藥物的敏感度有較大差別，尤其在特殊時期(如苗種期、脫殼期等) 使用藥物更需謹慎。實際生產中，所用藥物會受到溫度、pH、光照、溶解氧、有機物、各種水生生物等諸多因素的影響[20,42]，如敵百蟲在堿性環境下會轉化為敵敵畏，毒性大大增強。因此，在藥物使用過程中應充分了解其理化特性和使用方法，避免過量或過久的持續使用，進而造成不可逆的組織損傷。