炎癥微環境下過表達Wnt5a對人牙周膜干細胞增殖和成骨分化的影響

張 璇，王 辰，楊 琳，段 霏，楊燕美，顧 斌

1 解放軍總醫院第一醫學中心口腔科，北京 100853；2 解放軍總醫院研究生院，北京 100853；3 軍事科學院軍事醫學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850

牙周炎是一種復雜的慢性炎癥性疾病，主要表現為局部過度免疫反應和牙周支持組織的漸進性破壞，可能誘發心腦血管等多系統疾病，成為危害人類口腔乃至全身健康的一大疾患[1-2]?，F有牙周炎治療手段大多致力于清除致病菌和控制炎癥狀態，未能從根本上恢復牙周組織結構。近年來，干細胞相關組織工程技術已取得一定突破，從人牙周組織中分離發現的人牙周膜干細胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)成為最適宜牙周再生的候選種子細胞[3-4]。hPDLSCs是具有多向分化及自我更新能力的成體干細胞，具有低免疫原性及特異性，在牙周組織的維護、重建、再生和固定中發揮了重要作用[5-7]。大量研究證實，慢性牙周炎時局部炎癥微環境抑制了hPDLSCs的再生修復能力，明確炎癥微環境下hPDLSCs的增殖和成骨分化機制對牙周組織再生治療至關重要[8-10]。

Wnt 通路是炎癥微環境下影響干細胞骨向分化的重要調節途徑，包括由 β-catenin 介導的經典信號通路、非經典的 Wnt/Ca2+信號通路和 Wnt/PCP 信號通路[11]。Wnt5a是一種分泌型Wnt 配體，既能作用于經典Wnt/β-catenin通路[12]，又能通過非經典Wnt/Ca2+通路發揮作用[13]。越來越多的研究證明，在干細胞成骨分化過程中，Wnt5a發揮著潛在的雙重作用，并與細胞生長環境息息相關[14-15]。但關于Wnt5a對牙周膜干細胞成骨分化的影響仍待探究，Wnt5a對不同細胞成骨分化的影響可能與其局部微環境的狀態有關。本研究通過慢病毒轉染技術過表達hPDLSCs中的Wnt5a，進一步探究Wnt5a對炎癥微環境下hPDLSCs增殖及成骨分化的調控作用，為基于干細胞技術的牙周炎治療提供新的方法和理論依據。

材料與方法

1 實驗材料 慢病毒擴增載體 (Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，吉凱基因，中國)；α-MEM培養基、胎牛血清、PBS緩沖液、0.25%胰蛋白酶-EDTA (Gibco，美國)；青鏈霉素(Hyclone，美國)；Ⅰ型膠原酶(Sigma，美國)；CCK-8試劑盒(Dojindo，日本)；OriCell人相關干細胞成骨誘導分化試劑盒、人相關干細胞成脂誘導分化試劑盒(賽業生物，中國)；RNA提取試劑盒(天根生化，中國)；逆轉錄試劑盒(TaKaRa Bio，日本)；引物(生工生物工程，中國)；苯甲基磺酰氟PMSF、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(Selleck，美國)；RIPA裂解液、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色試劑盒(碧云天，中國)；Wnt5a、RUNX2、COL-1、GAPDH單克隆抗體(1∶1000，Cell Signaling Technology，美國)；山羊抗兔(1∶5000，Abcam，英國)；PVDF轉印膜(Millipore，美國)；BCA蛋白定量試劑盒、ECL顯影液、CO2恒溫孵箱(Thermo，美國)。

2 樣本收集 實驗所用離體牙均取自解放軍總醫院第一醫學中心口腔頜面外科門診，來源于8例(男性4例，女性4例) 18 ~ 25歲因正畸或阻生需要拔除無齲前磨牙及第三磨牙的患者。納入標準：牙周組織健康、無牙體疾病，無系統性疾病、血常規正常、無吸煙史、半年內無特殊服藥史。本實驗經解放軍總醫院醫學倫理委員會批準(批準號：S2022-688-01)，所有受試者均簽署知情同意書。

3 hPDLSCs分離培養 拔牙前對患者進行口腔潔治，拔牙時碘伏消毒，牙齒拔除后立即放入含雙抗的α-MEM 培養基中，在超凈工作臺中使用大量 PBS 緩沖液自根尖向冠方反復沖洗離體牙表面，刮取根中1/3牙周膜，移入含有Ⅰ型膠原酶的EP 管中并剪碎，在37℃ 恒溫孵箱消化45 min，期間每隔 15 min 震蕩一下。加入等量完全培養基(含 10% FBS、100 U/mL青霉素/鏈霉素的α-MEM培養基)終止消化，800 r/min離心5 min，留沉淀，重懸后置于培養皿(6 cm)，于37℃、5% CO2的恒溫箱培養7 ~ 10 d，觀察到細胞從組織塊邊緣爬出。細胞生長融合約80%時加胰蛋白酶(0.25%)-EDTA消化，為第1代hPDLSCs。通過有限稀釋法克隆培養，培養至3 ~ 5代以進行后續檢測。

4 慢病毒轉染 將hPDLSCs接種于 6 孔培養板中，調整細胞密度為5 × 104/mL。鏡下觀察細胞伸展匯合至60% ~ 70%時，分別加入陰性對照病毒和Wnt5a過表達慢病毒感染細胞(MOI=10)。在37℃恒溫孵箱中靜置12 ~ 16 h后觀察，更換為完全培養基。培養48 h后，通過熒光顯微鏡觀察細胞狀態。使用3 μg/mL工作濃度的嘌呤霉素(Puromycin)篩選48 h，擴增傳代后使用實時定量PCR、Western blot法驗證Wnt5a過表達效率，用于后續實驗。

5 構建炎癥微環境及細胞分組 將PDLSCs按照不同處理方法進行分組。(1)正常組：未經任何處理的 hPDLSCs；(2)炎癥組：用含10 ng/mL腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)培養基處理24 h的hPDLSCs；(3)陰性對照組：轉染陰性對照病毒的hPDLSCs； (4)過表達組：轉染過表達Wnt5a慢病毒的hPDLSCs；(5)TNF-α + 陰性對照組：用含10 ng/mL TNF-α的培養基處理24 h的陰性對照組hPDLSCs；(6)TNF-α + 過表達組：轉染過表達Wnt5a慢病毒并用含有10 ng/mL TNF-α的培養基處理的hPDLSCs。

6 CCK-8 法檢測細胞生長曲線 在 96 孔板中加入100 μL/孔的細胞懸液(2 × 103/孔，n=6)，培養24 h (37℃，5% CO2)使其貼壁，每隔2 d換液。在特定時間點(1 d、3 d、5 d、7 d)加CCK-8溶液(10 μL)，繼續孵育2 h后檢測吸光度(450 nm)，繪制生長曲線。

7 成骨誘導及茜素紅S (alizarin red S，ARS)染色實驗 將不同處理后的hPDLSCs制成細胞懸液接種于6孔板(5 × 104/mL)，使用α-MEM培養基(含10%胎牛血清)培養。待細胞生長融合達到60% ~70%時換為成骨誘導分化培養基培養2周，每隔3 d換液1次。待細胞聚集，出現鈣結節時，棄去誘導液，PBS沖洗3次，每次5 min。4%多聚甲醛固定30 min，加ARS染液。PBS沖洗3次，鏡下觀察并拍照。

8 ALP染色 對不同處理后的hPDLSCs 成骨誘導 7 d，去除孔板內的培養基。使用4% 多聚甲醛室溫固定，PBS 洗3 次，每次 5 min。加ALP染液，室溫避光孵育 30 min。棄去染液，蒸餾水清洗3 次，終止顯色。

9 實時定量 PCR檢測炎癥因子、成骨基因和Wnt5a的mRNA表達 提取待檢測細胞的總RNA，利用反轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA，以 cDNA 為模板使用實時熒光定量 PCR儀進行擴增。每組樣品設置3個復孔，數值均以內參基因GAPDH進行標準化，采用 2-△△Ct相對定量法檢測炎性細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)、成骨關鍵基因(RUNX2、COL-1、ALP)和Wnt5a的mRNA表達，引物序列見表1。

表1 實時定量PCR 引物Tab. 1 Primers of RT-qPCR

10 Western blot檢測RUNX2、COL-1和Wnt5a的蛋白表達 采用細胞裂解液試劑盒分別提取細胞總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，按照各組濃度定量至相同蛋白水平。采用10%的分離膠、電泳液和電轉液，蛋白上樣后以80 V電壓電泳30 min。待樣品進入分離膠，改為120 V電泳60 min。使用電轉槽250 mA電轉90 min，將蛋白移至PVDF膜上，將膜放入含5% BSA的封閉液內，在搖床上室溫封閉1 h。TBST搖床洗滌3次，5 min/次。加入一抗4℃孵育過夜。TBST洗去一抗后，按照一抗的種屬選擇相應濃度的兔源二抗室溫孵育1 h。通過ECL顯色試劑盒顯色，蛋白凝膠成像系統曝光成像，Image J軟件進行灰度值分析。

11 統計學分析 本研究所有實驗結果均重復3次，實驗數據采用GraphPad Prism 9.0進行統計學分析，通過Shapiro-Wilk進行正態性檢驗，數據以表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 牙周膜干細胞形態學觀察 酶消化法分離原代hPDLSCs，體外培養7 d后可見組織塊邊緣有貼壁細胞長出，見圖1A。10 d可見細胞數量增加，待匯合度達80%時開始傳代，傳代后細胞生長加速明顯，第1代細胞為紡錘狀和長條狀，似成纖維細胞，并呈漩渦狀聚集生長，見圖1B。

圖1 光鏡下觀察hPDLSCs形態 (100×)A：原代細胞培養7 d；B：P1 代細胞Fig.1 Observation of hPDLSCs under light microscope (100×)A: Primary cells were cultured for 7 d ; B: Cells of the first passage

2 炎癥微環境下 hPDLSCs 中炎癥因子和成骨相關基因的變化 成骨誘導 7 d 后，使用 10 ng/mL TNF-α刺激 hPDLSCs 24 h，通過 RT-qPCR 檢測炎癥因子IL-1β、IL-6和 TNF-α 的轉錄水平。如圖2所示，炎癥組IL-1β (t=33.19，P＜0.01)、IL-6(t=10.09，P＜0.01)和 TNF-α (t=9.157，P＜0.01)的mRNA表達水平均升高，表明已成功構建體外炎癥微環境。RT-qPCR 結果顯示炎癥組成骨相關基因 RUNX2 (t=3.248，P=0.031)、ALP (t=8，P＜0.01)和COL-1 (t=4.187，P=0.014)的表達均降低，而Wnt5a (t=5.861，P＜0.01)的水平升高，見圖3。上述結果證明TNF-α構建的炎癥微環境破壞了hPDLSCs的成骨分化潛力并上調了Wnt5a。

圖2 實時定量PCR檢測炎性因子mRNA相對表達量Fig.2 Relative mRNA expression level of inflammatory factors were detected by real-time quantitative PCR

圖3 實時定量PCR檢測正常及炎癥微環境下成骨相關基因和Wnt5a的mRNA表達量Fig.3 Relative mRNA expression level of osteogenic-related genes and Wnt5a were detected by real-time quantitative PCR

3 慢病毒轉染獲得過表達Wnt5a的hPDLSCs過表達Wnt5a慢病毒載體構建如圖4所示。感染細胞48 h 后通過倒置熒光顯微鏡觀察可見陰性對照組、過表達組的hPDLSCs 均顯示 GFP 綠色熒光(圖5)，表明慢病毒已成功轉染進細胞內。通過Western blot 及 RT-qPCR 檢測發現，與陰性對照組相比，過表達組Wnt5a 的mRNA表達量上升了13.57倍(t=97.45，P＜0.01)，蛋白水平的表達約上升了17倍(t=145.5，P＜0.01)，見圖6。

圖5 慢病毒感染人牙周膜干細胞 48 h 后熒光顯微鏡圖 (100×)Fig.5 Fluorescence microscopic observation of hPDLSCs after transfection for 48 hours (100×)

圖6 轉染Wnt5a過表達載體后hPDLSCs中Wnt5a mRNA和蛋白表達增加Fig.6 Wnt5a mRNA and protein expressions in hPDLSCs were significantly increased after transfection with Wnt5a overexpression vector,GAPDH served as an internal control

4 過表達Wnt5a對 hPDLSCs 增殖活力的影響CCK-8法檢測發現，在培養的前3 d內各組細胞生長曲線基本重合，5 d時細胞活力開始出現差異，7 d時可見炎癥組hPDLSCs增殖能力顯著高于對照組，提示炎癥微環境促進了hPDLSCs的增殖。過表達Wnt5a組在正常條件下細胞活力顯著增強(t=8.003，P＜0.01)，而在炎癥條件下其增殖能力顯著下降(t=11.89，P＜0.01)，見圖7。

圖7 CCK-8 法檢測不同處理組 hPDLSCs增殖Fig.7 CCK-8 assay detected the growth of hPDLSCs in different groups

5 正常環境及炎癥微環境下過表達Wnt5a對hPDLSCs成骨分化的影響 ALP 染色結果顯示，正常培養條件下Wnt5a過表達組的ALP 著色深度較陰性對照組淺，但在TNF-α刺激的炎癥微環境下，Wnt5a過表達組的ALP染色深于陰性對照組，見圖8。成骨誘導 21 d 后行ARS 染色，結果顯示正常培養條件下與陰性對照組相比，Wnt5a過表達組ARS 染色更深，鈣鹽結節形成量也更多。炎癥組Wnt5a過表達后，其著色深度及鈣結節的形成量均高于對照組，提示過表達Wnt5a對hPDLSCs成骨分化的抑制作用在炎癥微環境下被逆轉，見圖9。這也與RT-qPCR 和Western blot結果一致。成骨誘導培養 7 d 時，與對照組相比，正常培養條件下的Wnt5a過表達組COL-1、RUNX2的mRNA (t=7.165，P＜0.01；t=16.54，P＜0.01)和蛋白(t=36.48，P＜0.01；t=81.91，P＜0.01)表達水平顯著降低；而炎癥微環境下過表達Wnt5a組與對照組相比，其COL-1和RUNX2的mRNA (t=3.627，P=0.022；t=4.032，P=0.016)及蛋白 (t=57.27，P＜0.01；t=27.23，P＜0.01)表達水平顯著升高，見圖10、圖11，證明炎癥微環境下過表達Wnt5a對hPDLSCs成骨分化有促進作用。

圖8 成骨誘導第7天ALP染色結果(40×)Fig.8 ALP staining results on 7 d of osteogenesis induction (40×)

圖9 成骨誘導第21天茜素紅染色結果(100×)Fig.9 ARS staining results on 21 d of osteogenesis induction (100×)

圖10 實時定量PCR檢測成骨相關基因的mRNA表達水平Fig.10 mRNA expression levels of osteogenic genes were detected by RT- qPCR

圖11 Western blot檢測COL-1和RUNX2蛋白表達(定量數據表示所分析蛋白質的水平)Fig.11 The protein expressions of COL-1 and RUNX2 were detected by Western blot after 7 d of osteogenic induction (quantitative data represents the levels of analyzed proteins)

討 論

牙周炎是一種以局部免疫反應為主的炎癥性疾病，是我國成年人牙齒喪失的主要原因之一[16]。隨著牙周再生工程的飛速發展，hPDLSCs在牙周組織再生修復中的價值受到了越來越多的關注。近年來研究顯示，慢性牙周炎時大量促炎介質釋放，在對抗病原微生物的同時也誘導了牙周結構分解和代謝損傷，牙周炎患者局部特殊的炎癥微環境不利于牙周硬組織的修復[17-18]。因此，研究炎癥細胞因子在hPDLSCs骨形成和組織再生過程中的作用對于慢性牙周炎的治療具有重要意義。

Wnt5a是非經典Wnt/Ca2+信號通路的分泌型配體，參與了干細胞生長發育和炎癥相關疾病發生發展的全過程[19]。在炎癥發生的早期階段，Wnt5a/Fzd7復合物通過Ca2+誘導IL-10的分泌，阻斷TLR-2/NF-κB信號通路，以減輕炎癥反應[20]。隨著炎癥反應的發展，對抗微生物可使Wnt5a的表達上調和釋放增加，釋放出的Wnt5a又可以觸發促炎信號級聯并進一步增加炎性因子的分泌[21]。這些結果提示Wnt5a可能是潛在的炎癥因子，具有促炎和免疫的雙重作用。TNF-α是一系列抗炎過程中的上游因子，參與炎癥發生發展全過程[22]。TNF-α的作用是劑量依賴性的，濃度為10 ng/mL時成骨抑制尤其顯著，且刺激炎癥因子分泌量最高，可誘導干細胞產生明顯的炎癥反應[23-24]。同時，TNF-α濃度為10 ng/mL時，對細胞的增殖促進作用最為顯著[25]，此時細胞數量多且活性高。因此，本實驗選擇10 ng/mL TNF-α誘導炎癥微環境，結果證明炎癥微環境下hPDLSCs成骨分化能力受損，主要表現為TNF-α刺激后hPDLSCs中成骨關鍵基因RUNX2、ALP、OCN的mRNA表達水平降低，而炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達水平顯著升高，同時Wnt5a表達上調。這提示Wnt5a可能是PDLSCs在炎癥微環境下成骨分化能力減弱的分子機制。

RUNX2、COL-1和ALP在早期成骨過程中發揮著重要作用，是反映成骨分化的經典指標。RUNX2可直接調控成骨過程，通過調節細胞周期，加速成骨細胞分化和軟骨細胞成熟[26]。COL-1作為骨基質中含量最為豐富的部分，是組成骨骼和大多數結締組織的主要蛋白[27]。已有研究將帶有Wnt5a質粒的COL-1支架用于原位軟骨組織工程，Wnt5a質?？赏ㄟ^刺激聚集蛋白、Ⅱ型膠原蛋白和SOX9基因的表達，抑制軟骨肥大，促進軟骨修復。ALP表達于骨骼發育的初期，其表達水平與成骨細胞成熟程度呈正相關[28]。有研究發現高濃度的Wnt5a (100 ng/mL)顯著抑制ALP活性、礦化結節形成和成骨相關基因的表達，提示Wnt5a可能是干細胞骨形成的負調節因子[29]。然而，牙周炎狀態下的骨再生與正常骨形成存在一定差異，局部炎癥環境對hPDLSCs功能產生影響。因此，深入探究hPDLSCs在炎癥微環境中的骨向分化潛力，促進牙周組織再生，是干細胞治療能否成功的關鍵。

本實驗利用慢病毒在hPDLSCs中轉染重組Wnt5a，成骨誘導培養7 d時實時定量PCR及Western blot 檢測成骨關鍵基因的表達、ALP染色評估細胞體外礦化能力，成骨誘導21 d時ARS染色評估鈣結節形成能力，證明正常培養條件下過表達Wnt5a抑制hPDLSCs中RUNX2、COL-1及ALP的表達，Wnt5a參與了早期礦化過程。相反，在炎癥微環境下過表達Wnt5a后，hPDLSCs中RUNX2、COL-1的mRNA和蛋白表達水平以及鈣化結節形成量增加，表明Wnt5a在炎癥微環境下促進hPDLSCs成骨分化，過表達Wnt5a后hPDLSCs的成骨分化能力增強。此外，本實驗還研究了過表達Wnt5a在炎癥微環境下對hPDLSCs增殖能力的影響。CCK-8檢測發現前3 d細胞生長曲線基本重合，從4 d開始各實驗組增殖能力出現顯著差異。與對照組相比，炎癥刺激下hPDLSCs的增殖能力增強，這與既往研究結果一致[23]。過表達Wnt5a在正常環境下促進hPDLSCs增殖，炎癥環境下其增殖活力卻顯著下降，這意味著炎癥微環境下hPDLSCs再生能力可能隨著Wnt5a的增加而減弱。

綜上所述，本研究證明了炎癥微環境會損傷hPDLSCs的成骨分化潛力并上調Wnt5a；正常培養條件過表達Wnt5a后，hPDLSCs增殖能力增強、骨向分化能力減弱，說明Wnt5a作為負調節因子介導了人牙周膜干細胞的成骨分化過程。但在TNF-α刺激的炎癥微環境下，Wnt5a對hPDLSCs成骨的抑制作用被逆轉。目前對于炎癥微環境下hPDLSCs再生機制的研究還很少，但許多研究已經提示Wnt5a可能作為治療炎癥相關骨性疾病的潛在靶點，未來還需要進一步探索其下游信號分子的潛在機制，并為基于干細胞治療的牙周再生提供新思路。

致謝我們要感謝實驗室主任段小濤、王勃研究員對實驗資源的提供和出色的技術支持。感謝軍事科學院軍事醫學研究院提供的顯微鏡和圖像分析服務。

作者貢獻張璇：總體構思，數據管理，規范分析，資金獲取，調查研究，方法設計，有效驗證，可視化處理，撰寫初稿，審讀和修訂；王辰：數據管理， 資金獲取，調查研究；楊琳：調查研究，資金獲取，有效驗證；段霏：調查研究，數據管理，項目管理；顧斌：總體構思，資金獲取，項目管理，資源提供，監督指導，審讀和修訂；楊燕美：總體構思，項目管理，資金獲取，方法設計，監督指導，審讀和修訂。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數據共享聲明支持本研究結果的數據可根據合理要求從第一作者和通信作者處獲得。