與白蛋白結合的PSMA靶向分子[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA的制備及初步顯像

羅田偉,孫明月,張文輝,高 菲,王 寧,黃旭虎,陳 歡,李洪玉,*

1.原子高科股份有限公司,北京 102413;2.國家原子能機構核技術(放射性藥物工程轉化)研發中心,北京 102413;3.中國核工業集團有限公司 放射性藥物工程技術研究中心,北京 102413

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是男性最常見的惡性腫瘤之一,它是一種具有明顯異質性的惡性實體腫瘤,起病隱匿,早期癥狀不明顯且無特異性,但其較高的腫瘤轉移性常會導致患者生存率降低,嚴重威脅中老年男性的健康[1-3]。國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer, IARC)的統計數據顯示,2020年全球前列腺癌發病率在男性所有惡性腫瘤中位居第2,死亡率占第5位,每年發病人數達到140萬例,每年因患前列腺癌的死亡人數更是達到38萬例[4]。我國前列腺癌患病率雖然低于歐美發達國家,但近年來也呈顯著上升趨勢。

前列腺特異性膜抗原(PSMA)是一種高表達于前列腺癌(PCa)的Ⅱ型跨膜蛋白,PSMA在90%以上的PCa病灶及相關的骨和淋巴結轉移病灶中都高度過表達,表達水平隨著腫瘤去分化程度、轉移性和激素抵抗性的增加而增加,但在正常人體組織中低表達,表達水平僅為前列腺癌的1‰～1%[5-8]。

PSMA被認為是前列腺癌診斷和治療的理想靶點,靶向PSMA的配體應具有高選擇性,能夠高效、靶向的與前列腺癌細胞表面的PSMA特異性結合[9-10]。谷氨酸-脲-賴氨酸(Glu-Urea-Lys)作為靶向PSMA的基團,能夠高效、特異性地與PSMA結合,具有便于合成及純化、易于連接其他分子、易溶于水、能穩定儲存等特點,是近年來靶向PSMA放射性藥物研究及開發的重點。PSMA-11、PSMA-617、PSMA-I&T就是基于該靶向基團的代表化合物[11-14]。

雖然靶向PSMA的配體在前列腺癌的診斷與治療方面已取得了一定的進展[15-16],但目前仍存在一定的局限性,比如藥物的生物半衰期較短,在生物體內代謝速度過快,造成腫瘤部位有效劑量較低、保留時間過短,需要使用高劑量(活度)才能達到治療效果;此外,在腎臟、骨及唾液腺的高攝取還會引起不同程度的腎毒性、骨髓毒性及口干癥等副作用,增加了不良反應的風險。為此,需要對該類藥物進行持續的改進和優化,以改善藥物的藥代動力學特征,增強藥物在腫瘤部位的攝取和滯留,進一步提高藥物的有效性并降低不良反應,使其適合用作PSMA高表達腫瘤的核素治療和顯像,滿足臨床需求[17-19]。

研究發現,在小分子抑制劑的連接部位引入Even Blue(EB)、4-(對-碘苯基)丁酸(IP)或者4-(對-甲苯基)丁酸(CP)等白蛋白結合基團可以顯著延長藥物的血液循環時間,增加腫瘤攝取。2018年,文獻[20-21]在PSMA-617的結構上引入了可以和白蛋白結合的基團EB,在注射到小鼠體內后,90Y和177Lu標記的 EB-PSMA-617與[177Lu]Lu-PSMA-617 相比表現出更長的血液半衰期、更高的腫瘤累積和更好的治療效果。同年文獻[22-24]報道4-(對-碘苯基)丁酸(IP)和4-(對-甲苯基)丁酸(CP)對白蛋白有很強的結合力,并能顯著改善放射性藥物的體內生物半衰期和腫瘤攝取。本研究擬選擇1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四羧酸(DOTA)為雙功能螯合劑,以Glu-Urea-Lys為靶向基團,在抑制劑連接部位引入可以和白蛋白結合的 4-(對-甲苯基)丁酸基團及喹啉環[18],以延長靶向藥物的生物半衰期,增加藥物在腫瘤組織的攝取和滯留,并減少其在非靶組織的攝取。采用無載體177Lu核素進行標記,合成一種新型靶向PSMA的藥物分子[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA,分別考察反應pH、反應時間、反應溫度等因素對放射化學純度的影響,確定最佳標記條件;在此基礎上,對標記物的理化性質和體內生物活性進行評價,測定脂水分配系數、考察藥物的體外穩定性、開展單光子發射及X射線計算機斷層掃描(SPECT/CT)顯像研究,并以[177Lu]Lu-PSMA-I&T為對照化合物對相關結果進行比對。

1 實驗方法

1.1 材料和儀器

N6-(Fmoc)-N2-(((S)-1,5-二叔丁基-1,5-戊烷二酮)氨基甲酰)-L-賴氨酸(N6-(((9H-fluoren-9yl)methoxy)carbonyl)-N2-(((S)-1,5-di-tert-butoxy-1,5-dioxopentan-2-yl)car bamoyl)-L-lysine),純度95%,浙江致新醫藥科技有限公司;Fmoc-3-(3-喹啉)-1-丙氨酸(Fmoc-3-(3-Quinolyl)-L-Ala-OH),純度98%,吉爾生化(上海)有限公司;反式-4-(N-芴甲氧羰基氨基甲基)環己烷甲酸,純度97%,蘇州愛瑪特生物科技有限公司;N-Fmoc-N′-[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環己亞基)乙基]-L-賴氨酸(Fmoc-Lys-(Dde)-OH),純度98%,吉爾生化(上海)有限公司;1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸三叔丁酯(DOTA-(0tBu)3),純度97%,成都普康生物科技有限公司;4-(對-甲苯基)丁酸,純度99.91%,樂研試劑。

無載體177LuCl3溶液,德國 ITM公司,放射性活度濃度40 GBq/mL,比活度3 609 GBq/mg,放射化學純度100.0%;PSMA-I&T,浙江昂拓萊司生物技術有限公司;鹽酸,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;醋酸、醋酸鈉,成都華邑藥用輔料制造有限責任公司;龍膽酸,安徽山河藥用輔料股份有限公司;滅菌注射用水,石家莊四藥有限公司;乙腈(色譜純),德國Merck公司;超純水,德國Millipore純水儀制造;異氟烷,純度99.998%,深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

CRC-55tW 活度計,美國Capintec公司;Vanquich Core高效液相色譜儀,默飛世爾科技(中國)有限公司;Advancebio peptide map色譜柱(φ4.6 mm×150 mm,填料粒徑2.7 μm),安捷倫公司;γ-Cube/X-Cube小動物SPECT/CT影像設備,Molecubes NV公司;移液槍,Eppednorf公司;干式加熱器,美國萊伯特(Labnet)公司;精密pH試紙,上海三愛思試劑有限公司;22RV1荷瘤裸鼠:由中國醫學科學院醫藥生物技術研究所提供,采用雌性4～6周齡balb/c裸鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司),右側腋窩下接種22RV1腫瘤細胞(5×106),培養10～15 d左右待腫瘤體積達到要求,用于實驗。

1.2 前體化合物DOTA-CPN-PSMA的合成和表征

1.2.1前體化合物DOTA-CPN-PSMA的合成 合成路線示于圖1,具體反應步驟如下所述:

第一步:在反應器中加入CTC 樹脂、化合物1、N-乙基二異丙胺(DIPEA)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。將混合物鼓氣3 h后,依次用三倍樹脂床體積的DMF、甲醇洗滌3遍后真空抽干過夜,得到化合物2。該步收率約為62.5%。

第二步:將上述樹脂加入反應器中,重新用DMF溶脹2 h。加入三倍樹脂床體積的φ=20%六氫吡啶/DMF溶液鼓氣30 min脫除芴甲氧羰基(Fmoc)保護基,用三倍樹脂床體積的DMF洗5遍。隨后加入Fmoc-3-(3-喹啉)-L-丙氨酸、2-(7-氮雜苯并三氮唑)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、N-甲基嗎啡啉和0.5倍樹脂床體積的DMF,鼓氣1 h,取少量樹脂進行茚三酮檢測,顯示陰性。將反應液濾除,用三倍樹脂床體積的DMF洗滌3遍。重復脫除Fmoc以及氨基酸連接的步驟,將氨甲環酸、Lys(Dde)以及DOTA(tris tBu)接到樹脂上,得到化合物3。收率接近100%。

第三步:在化合物3中加入三倍樹脂床體積的φ=2%水合肼/DMF溶液,鼓氣30 min后,濾除反應器內溶液,用三倍樹脂床體積的DMF洗滌5遍,得到化合物4。收率為100%。

第四步:在反應器中加入2倍4-(對-甲苯基)丁酸、1.9倍HATU、4倍N-甲基嗎啡啉和0.5倍樹脂床體積的DMF,鼓氣1 h,取少量樹脂進行茚三酮檢測,顯示陰性。將反應液濾除,用三倍樹脂床體積的DMF洗滌3遍、叔丁基甲醚洗滌3遍后真空抽干得到化合物5。收率接近100%。

第五步: 將樹脂(化合物5)中加入φ=95%三氟乙酸(TFA)/水溶液,在25 ℃下攪拌3 h。過濾樹脂,在濾液中加入-20 ℃的叔丁基甲醚,離心,倒掉上清液,加入叔丁基甲醚攪碎沉淀后再次離心,倒掉上清液后放入恒溫干燥箱中16 h,抽干叔丁基甲醚(得到粗品)。用HPLC純化和換鹽后用冷凍干燥機凍干得到DOTA-CPN-PSMA的醋酸鹽白色凍干粉(總收率為24.0%)。

1.2.2前體化合物DOTA-CPN-PSMA的表征 質譜條件:ESI正離子工作模式;循環時間為1.1 s,駐留時間0.1 s;離子源溫度為120 ℃,脫溶劑溫度為350 ℃;質量范圍為200～2 000。色譜條件:色譜柱為安捷倫Advancebio peptide map色譜柱;流動相A為含φ=1‰TFA的超純水,流動相B為含φ=1‰TFA的乙腈;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測波長為220 nm;進樣量為10 μL;按表1條件進行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradient elution procedure

1.3 [177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA標記條件的研究

[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA的結構式示于圖2。為了保證藥物的質量,防止其發生輻射自分解,在標記過程中加入了約1 mg的龍膽酸。

圖2 [177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA的結構式Fig.2 Structure of [177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA

1.3.1反應體系pH的影響 取DOTA-CPN-PSMA前體,使用滅菌注射用水配制成1 g/L的溶液。移取10 μL上述溶液加入反應瓶中,隨后依次加入含有龍膽酸的醋酸鈉緩沖溶液、約370 MBq177LuCl3鹽酸溶液和滅菌注射用水,搖勻后使用精密pH試紙測其pH值(使用醋酸鈉緩沖溶液調節反應液的pH值為3.5～6.0)。將反應瓶置于干式加熱器中94 ℃加熱,冷卻后取其溶液使用HPLC測試其放射化學純度。

1.3.2反應溫度的影響 移取10 μL PSMA溶液于反應瓶中,加入含有龍膽酸的醋酸鈉緩沖溶液。隨后加入滅菌注射用水和370 MBq177LuCl3鹽酸溶液,搖勻后將反應瓶分別放置在室溫、40、60、70、80、94 ℃加熱,冷卻后取其上層清液使用HPLC測試其放射化學純度。

1.3.3反應時間的影響 移取10 μL PSMA溶液于反應瓶中,加入含有龍膽酸的醋酸鈉溶液。隨后加入滅菌注射用水和370 MBq177LuCl3鹽酸溶液,搖勻后將反應瓶置于干式加熱器中分別加熱5、10、15 min,冷卻后取其上層清液使用HPLC測試其放射化學純度。

1.3.4177Lu/PSMA(mCi/μg,1 Ci=3.7×1010Bq)投料比的影響 分別移取2.5、5.0、10.0 μL PSMA溶液于10 mL西林瓶中,加入含有龍膽酸的醋酸鈉溶液。隨后加入滅菌注射用水和370 MBq177LuCl3鹽酸溶液,使177Lu/PSMA的投料比分別為4∶1、2∶1、1∶1,搖勻后將反應瓶分別加熱10 min,冷卻后取其上層清液使用HPLC測試其放射化學純度。

1.3.5[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA的質量控制 取適量樣品在鉛玻璃后目視觀察本品外觀。沾取適量樣品至精密pH試紙上,立即觀察試紙顏色并與比色板比較,記錄pH值。放射化學純度分析采用HPLC方法,色譜條件與前體化合物DOTA-CPN-PSMA的液相色譜條件相同,參見1.2.2節。

1.4 [177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA體外穩定性的測定

[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA體外穩定性實驗分別在生理鹽水和牛血清兩種體系中進行。生理鹽水:將放射性標記物置于生理鹽水中在37 ℃下分別孵育1、24、48、72 h 后,使用HPLC測定其放射化學純度,以測定其體外穩定性;牛血清溶液:將放射性標記物置于小牛血清(BSA)溶液中,在37 ℃下分別孵育1、24、48、72 h后,使用HPLC測定其放射化學純度。

1.5 脂水分配系數的測定

將[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA分別加入含有相同體積正辛醇和水(0.5 mL∶0.5 mL)的EP 管中,蓋好后充分振蕩5 min,在離心機中離心分層5 min,轉速為2 000 r/min。分別取有機相和水相各100 μL于放免管中,在井型γ探測器中分別測量其放射性計數率,由有機相和水相放射性計數率的比值來計算脂水分配系數(P):

P= lg(NO/NW)

式中,NO和NW分別為有機相和水相樣品的放射性計數率,s-1。重復操作3次,取平均值,計算出標記物的脂水分配系數。對照化合物[177Lu]Lu-PSMA-I&T采用同樣的方法測試其脂水分配系數。

1.6 荷瘤鼠Micro-SPECT顯像研究

取0.1 mL(約29.6 MBq)的[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA和[177Lu]Lu-PSMA-I&T(對照化合物)分別通過尾靜脈注射到22RV1荷瘤小鼠體內。隨后將用異氟烷麻醉的動物俯臥式固定在小動物SPECT和CT掃描儀上,分別在給藥后1、4、24、72 h進行靜態影像采集,掃描時間為20 min。掃描結束后,使用基于GPU的3D MLEM和ISRA算法分別對SPECT、CT圖像進行重建,獲得成像結果[25]。

2 結果與討論

2.1 前體化合物DOTA-CPN-PSMA的結構表征

前體化合物DOTA-CPN-PSMA為白色或類白色凍干粉末或疏松塊狀物,相對分子質量為1 331,質譜圖示于圖3,其中m/z=1 332.8處為(M+H) 峰,m/z=666.4處為(M+2H)/2 峰,m/z=444.7處為(M+3H)/3峰,質譜確證合成的DOTA-CPN-PSMA結構正確。液相方法如1.3.5節所述,檢測圖譜示于圖4,化學純度>95%,紫外峰保留時間為 8.25 min,符合使用要求。

圖3 前體化合物DOTA-CPN-PSMA的質譜圖Fig.3 Mass spectrum of DOTA-CPN-PSMA

圖4 前體化合物DOTA-CPN-PSMA的HPLC紫外圖譜Fig.4 HPLC UV chromatogram of DOTA-CPN-PSMA

反應溫度94 ℃,反應時間10 min,177Lu/PSMA(mCi/μg)投料比1∶1圖5 反應pH對放射化學純度的影響Fig.5 Influence of pH on radiochemical purity

2.2 [177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA的標記條件

分別考察反應體系pH、反應溫度、反應時間、177Lu/PSMA(mCi/μg)投料比等因素對放射化學純度的影響,優化標記條件。

2.2.1反應體系pH的影響結果 在氯化镥[177Lu]配位PSMA靶向配體的過程中,反應pH將會對藥物[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA的標記產生重要影響,因此必須將pH值控制在合理的范圍內,pH值太小(pH<3),DOTA配體易被質子化,降低形成金屬配合物的效率;而pH值太高(pH>7),氯化镥[177Lu]及產品容易形成膠體,影響產品質量。反應體系pH值對放射化學純度的影響示于圖5。圖5結果表明,當反應溫度為94 ℃、反應時間為10 min時,反應pH值為3.5～5.5,標記物的放射化學純度均可達97%以上。當pH值為5.5～6.0時,放射化學純度下降到約86%,遠低于95%,不滿足使用要求。因此,該反應體系pH范圍為3.5～5.5。

2.2.2反應溫度的影響結果 反應溫度對放射化學純度的影響示于圖6。如圖6所示,隨著反應溫度的升高,標記物的放射化學純度逐漸升高。當反應溫度為室溫時,反應10 min,放射化學純度為41%;當溫度為40 ℃時,反應10 min,放射化學純度約為81%;當反應溫度高于60 ℃(60、70、80、94 ℃),同樣的反應時間標記物的放射化學純度均≥98%。因此,此體系反應溫度范圍較寬,為60～94 ℃。

pH=4.0～4.5,反應時間10 min,177Lu/PSMA(mCi/μg)投料比1∶1圖6 反應溫度對放射化學純度的影響Fig.6 Influence of reaction temperature on radiochemical purity

pH=4.0～4.5,反應溫度70 ℃,177Lu/PSMA(mCi/μg)投料比1∶1圖7 反應時間對放射化學純度的影響Fig.7 Influence of reaction time on radiochemical purity

2.2.3反應時間的影響結果 反應時間對放射化學純度的影響示于圖7。圖7結果表明,當反應pH值為4.0～4.5、反應溫度為70 ℃時,反應時間在5～15 min,放射化學純度均可達98%以上。即使在室溫條件下反應,將反應時間從10 min延長到24 h后,放射化學純度也可由41%提高到95%。

2.2.4投料比的影響結果 分別考察了177Lu/PSMA(mCi/μg)投料比分別為1∶1、2∶1、4∶1(摩爾比約為1∶10 、1∶5、1∶2.5)的情況下對放射化學純度的影響,結果示于圖8。如圖8所示,當投料比分別為1∶1、2∶1時,放射化學純度高于95%,達到98%以上;當投料比為4∶1時,放射化學純度有所降低,下降到90.70%。

pH=3.5～5.5,反應溫度60～94 ℃,反應時間為10 min圖8 投料比對放射化學純度的影響Fig.8 Influence of 177Lu/PSMA ratio on radiochemical purity

綜上所述,確定了[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA的標記反應條件:在加入穩定劑的情況下,177Lu/PSMA(mCi/μg)投料比為1∶1～2∶1、反應pH值為3.5～5.5、反應溫度為60～94 ℃、反應時間為5～15 min。在此條件下,產品的放射化學純度符合要求(在95%以上)。

所制標記化合物[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA為無色澄明液體,pH為3.5～5.5,放射性比活度為3.7×1013Bq/g,放射化學純度>95%,最高可達99%,說明制得的[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA無需使用C18小柱純化,標記完成即可直接用于下一階段實驗。液相檢測圖譜示于圖9。如圖9所示,其放射性峰的保留時間為 8.15 min,游離177Lu3+的放射性峰保留時間為2.00 min,[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA與游離177Lu3+的放射性峰保留時間相差較大,可有效分開。

圖9 標記化合物[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA的HPLC圖譜Fig.9 Radio-HPLC chromatogram of [177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA

2.3 體外穩定性

[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA體外穩定性在生理鹽水和牛血清兩種體系中進行,樣品的放射性濃度為0.5 mCi/mL。37 ℃下標記物在生理鹽水及牛血清中放置24 h后,放射化學純度均有所下降,但仍大于95%;存放至72 h后,放射化學純度均低于95%。在兩種體系中[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA均可穩定存放24 h,穩定性良好。

2.4 脂水分配系數

對[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA和[177Lu]Lu-PSMA-I&T的脂水分配系數進行了檢測,根據所測得的數據計算[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA的脂水分配系數為-2.02,與[177Lu]Lu-PSMA-I&T的脂水分配系數-3.15相比,具有更高的親脂性,符合結構設計的預期。

2.5 荷瘤鼠的Micro-SPECT顯像

[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA在荷22RV1前列腺癌裸鼠體內的SPECT/CT顯像結果示于圖10。由圖10可知,[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA在荷瘤鼠體內靶向性好,在腫瘤組織中表現出放射性濃聚,說明腫瘤對[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA有高攝取。在4 h其腫瘤組織的放射性攝取達到6.2%ID/g,明顯高于對照藥物[177Lu]Lu-PSMA-I&T的值(2.9%ID/g)。此外[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA在腫瘤中的滯留時間長,72 h后在腫瘤組織中仍有攝取,而對照藥物[177Lu]Lu-PSMA-I&T (圖11)在72 h后已基本從荷瘤鼠體內完全清除,在腫瘤中也幾乎沒有攝取。[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA與[177Lu]Lu-PSMA-I&T一樣主要通過腎臟代謝,且在腎臟中的攝取低于[177Lu]Lu-PSMA-I&T;除腫瘤組織和腎臟外,[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA在膀胱中有較高攝取,在其他組織中攝取均較低。

圖10 荷瘤小鼠在注射[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA后的SPECT/CT顯像圖Fig.10 SPECT/CT images of [177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA in nude mice bearing 22RV1 tumor after injection

圖11 荷瘤小鼠在注射[177Lu]Lu-PSMA-I&T后的SPECT/CT顯像圖Fig.11 SPECT/CT images of [177Lu]Lu-PSMA-I&T in nude mice bearing 22RV1 tumor after injection

顯像結果表明,相較于對照藥物[177Lu]Lu-PSMA-I&T,[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA表現出更好的藥代動力學特征,具有更高的腫瘤攝取與滯留,更低的腎臟攝取。

3 結 論

對[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA的前體合成、核素標記、質量研究、體外穩定性、脂水分配系數及Micro-SPECT/CT顯像進行了初步研究,結果表明:

(1)177Lu標記靶向PSMA配體DOTA-CPN-PSMA方法簡便,反應時間短,放射化學純度可達95%以上、最高可達99%以上,無需使用C18柱或者HPLC制備柱進行純化;

(2) 標記物的體外穩定性較好,在生理鹽水及牛血清中可以穩定存放24 h,放射化學純度依然高于95%;

(3) [177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA在荷瘤鼠體內靶向性好,滯留時間長,主要通過腎臟代謝;與目前國外正在開展臨床Ⅲ期的藥物[177Lu]Lu-PSMA-I&T相比,其具有更高的腫瘤攝取與滯留,而且腎臟攝取更低,提示其對腎臟的輻照毒性可能降低。

初步的研究結果表明,[177Lu]Lu-DOTA-CPN-PSMA值得作為治療前列腺癌的候選藥物開展進一步研究。