兩株分離自木塑復合材料的腐朽真菌的分離鑒定及其腐朽性能研究

馮 靜，施慶珊，文 霞，蘇皚庭，黃健聰，謝小保

1.廣東省科學院微生物研究所，廣東 廣州 510070；2.廣東省微生物分析檢測中心，廣東 廣州 510070；3.華南應用微生物國家重點實驗室，廣東 廣州 510070；4.廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東 廣州 510070

木塑復合材料是由木質纖維與熱塑性塑料混配后經特殊工藝處理成型的一種新型材料，由于兼具木質和塑料的優點，且具有易加工、可生物降解、原料來源豐富等的特點，被廣泛應用于建筑、家居、園林景觀、包裝運輸及倉儲等領域[1]。在木塑材料開發及應用的早期，由于木質纖維被塑料基體有效包裹，人們大多認為該材料具有足夠的真菌抗性。然而，隨著木質纖維含量的增加、產業的快速發展及應用領域的不斷拓展，人們發現，木填充量高的木塑制品和天然木材一樣，也會受到真菌、白蟻、藻類等生物因子的侵蝕，其中以真菌對木塑材料的危害最為嚴重[2-4]。

研究表明，在人工模擬加速試驗條件下，多種腐朽真菌，如粉孢革菌（Coniophoraputeana）、采絨革蓋菌（Coriolusversicolor）、密粘褶菌（Gloeophyllumtrabeum）、變色栓菌（Trametesversicolor）、 綿腐臥孔菌（Poriavaporaria）、潔麗香菇（Lentinuslepideus）、鮭色波斯特孔菌（Postia placenta）、裂褶菌（Schizophyium commune）、血紅密孔菌（Pycnoporussanguineus）、瘤蓋干酪菌（Tyromycespalustris）、深紅密孔菌（Pycnoporuscoccineus） 及瘤蓋擬層孔菌（Fomitopsispalustris）等均可侵染并攻擊木塑材料，導致其質量減輕、力學及機械性能退化，吸水性能增加[5-12]。

然而，目前尚無有關實際生產和應用中危害木塑材料的真菌種群的研究報道?；诖?，本研究通過采集被真菌侵染后受損的木塑復合材料，利用傳統微生物學和現代分子生物學的方法對危害木塑材料的真菌進行分離鑒定，并對其腐朽性能進行相關測試，以確定在實際應用中危害木塑材料的主要真菌種群，有望為木塑材料真菌危害的相關控制策略及木塑材料真菌危害的相關國家標準的制定（如試驗所用標準菌株的選擇）提供前期的理論和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

受損木塑復合材料采集自安徽某木塑復合材料示范園區，表面可見真菌侵蝕及腐朽痕跡。將在自然條件下被真菌感染的木塑試樣用無菌手術刀切割一部分并裝于采樣袋中帶回實驗室備用。

1.2 供試培養基

菌株的分離及純化培養所用培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂15.0 g/L。

菌株耐腐性能的測試采用河砂鋸屑培養基，配置方法如下：在500 mL 培養瓶中分別加入洗凈干河砂150 g（篩孔尺寸0.600～0.850 mm，粒度20～30目）、木屑15 g、玉米粉8.5 g、紅糖1 g，拌勻平整后，在培養基表面放入各自分離的飼木3 塊，再向培養瓶中徐徐加入100 mL 麥芽糖液（波梅氏比重1.03），于121 ℃高壓蒸汽滅菌1 h，待冷卻后接種。

1.3 菌株的分離及純化

在無菌操作臺上用濕潤的無菌脫脂棉球輕輕擦拭受損木塑試樣表面的真菌感染區域，用無菌雙蒸水充分洗滌擦拭棉球后便可得到含真菌孢子的孢子原液。將該孢子原液按濃度梯度稀釋后取適量涂布于PDA 平板上，于28 ℃培養箱中培養7 d 后，挑取單菌落轉接于另一PDA 平板上，直至獲得純菌落。然后將其轉接至PDA 斜面培養基上培養至菌株長滿斜面，存放于4 ℃冰箱中，保存備用。

1.4 菌株的形態學鑒定

將獲得的純化菌株置于PDA 上培養7 d，觀察菌落在PDA 平板上的形態特征。挑取PDA 上培養的真菌菌絲制作臨時載玻片，以滅菌水為介質，采用Nikon E200 生物顯微鏡攝像系統觀察菌絲及分生孢子的形態特征并進行顯微拍照。從PDA 培養基上切取真菌菌落，經戊二醛固定、磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗、乙醇梯度脫水、叔丁醇置換、冷凍干燥并噴金后，用掃描電子顯微鏡（HITACHI S-3000N）觀察菌絲及孢子的形態特征。綜合菌株的平板培養特性及顯微特征，參考相關真菌分類學資料進行形態鑒定。

1.5 菌株分子生物學鑒定

采用18S rRNA 及ITS 序列擴增法對菌株進行分子生物學鑒定。挑取PDA 上培養7～10 d 的真菌菌絲體，用Magen（美基）真菌DNA 提取試劑盒提取基因組DNA。以提取到的DNA 為模板，采用真菌通用18S rRNA 及ITS 序列引物進行PCR 擴增（表1）[13]。PCR 反應體系為50 μL: 2×Taq Master Mix 25 μL，Primer 1 （10 μmol/L）2 μL，Primer 2（10 μmol/L）2 μL，模板DNA 1 μL，用ddH2O 定容至50.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min40 s，循環36次；72 ℃延伸15 min。PCR 擴增產物純化后委托北京擎科生物科技有限公司廣州分公司進行測序。

表1 真菌通用18S rRNA 及ITS 序列引物信息

在GenBank 中對獲取的基因序列進行同源比對，下載相似序列后使用MEGA 6.0 構建系統發育樹（Neighbor-joining 法），確定菌株分類。

1.6 腐朽性能測試

參照國家標準GB/T 13942.1-2009（木材耐久性能第1 部分：天然耐腐性實驗室試驗方法）進行[14]。取未經處理的天然黃瑾木材，加工切割成大小約50 mm×30 mm×10 mm 的樣品。將木材樣品放入105 ℃烘箱中烘至恒重后，對樣品編號、稱重（精確到0.0001g）并記錄，將木材樣品于121 ℃高壓滅菌20 min 后備用。

使用無菌打孔器，對PDA 平板上培養7～10 d的菌絲塊（直徑約5 mm）進行切取。將這些菌絲塊接入河砂木屑培養基的中央部分，并在28 ℃、相對濕度（RH）85%的培養箱中培養，直至菌絲完全覆蓋培養基表面。在無菌條件下，輕輕將木材試樣置于培養基的中間部位，每個樣品設置4 個相同的對照組。將培養瓶置于28 ℃、RH 85%的條件下培養12 周后，取出木材試樣，除去表面的菌絲和雜質。將其置于105 ℃烘箱中烘至恒定重量后使用稱重器進行質量測量。按照以下公式計算木材試樣在腐朽真菌侵染后的質量損失率。

式中：W1：木材試樣腐朽試驗前干重，W2：木材試樣腐朽試驗后干重。

1.7 紅外光譜（FTIR）分析

取腐朽試驗前后的黃槿木材試樣品，在105 ℃烘箱中烘至恒重后，用刀片在樣品表面刮取少許木屑，與KBr 混均壓片后用Avatar 370 型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）（美國Thermo Nicolet 公司）進行紅外光譜測定。掃描波長范圍為4 000～450 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描32 次。

2 結果與討論

2.1 菌株分離及形態學鑒定

對受損木塑試樣上的真菌菌株進行分離純化后得到兩株腐朽真菌，編號分別為WPC-11 和WPC-12。兩株菌株的平板菌落、顯微形態及SEM 圖如圖1、2 所示。

圖1 腐朽真菌WPC-11 的平板（a）、顯微鏡（b）及SEM（c）圖片

WPC-11 在PDA 平板上的菌落特征如下：菌落圓形，顏色為白色、不透明，菌絲細絨毛狀，菌絲體發達，有明顯腐朽味。菌絲生長速度較快，PDA 上培養7 d 后直徑約為65 mm。光學顯微鏡下，可見菌絲系統的二體型，生殖菌絲無色，薄壁，具鎖狀聯合（圖1中白色箭頭所示）；骨架菌絲無色，厚壁，擔孢子近球形，長橢圓形到橢圓形。SEM 掃描電鏡下可見其菌絲無色、平滑，可清晰發現鎖狀聯合結構上的鎖狀結構。

WPC-12 在PDA 平板上的菌落特征如圖2 所示。由圖可知，菌落圓形，顏色為白色至米白色，菌絲絨兼絮狀，不產孢或產孢量極少，菌絲體發達，有明顯腐朽味。菌絲生長速度快，PDA 上生長7 d 即可鋪滿整個平皿（直徑90 mm）。光學顯微鏡下，可見菌絲系統二體型，生殖菌絲無鎖狀聯合，無色，薄壁，分支很少；骨架至纏繞菌絲無色，厚壁，彎曲，多分枝；擔孢子橢圓形至圓柱形，無色，薄壁，平滑。SEM掃描電鏡下可見其菌絲無色、平滑。

圖2 腐朽真菌WPC-12 的平板（a）、顯微鏡（b）及SEM（c）圖片

2.2 菌株的分子生物學鑒定

通過擴增WPC-11 菌株ITS 和18S rDNA 片段，分別獲得一條604 bp 和1639 bp 的基因序列。通過在GenBank 中進行序列比對分析，結果均顯示WPC-11 菌株的序列與Perenniporia sp.屬菌株的相似度最高。WPC-11 菌株基于ITS 序列同源性構建的系統發育進化樹如圖3 所示，WPC-11 以84%及78%的支持率與P.subtephropor、P.cinereofusca 聚在同一大支上，并以99%的支持率與P.vanhullii 排列在同一小分支上。結合形態學特征與分子生物學的鑒定結果，將WPC-11 鑒定為白腐菌多年臥孔菌屬（Perenniporia sp.）菌株。

圖3 菌株WPC-11 及WPC-12 腐朽前后黃瑾木材試樣的SEM 圖

圖3 木腐真菌WPC-11 的系統進化樹構建

菌株WPC-12 的ITS 和18S rNDA 序列擴增后，分別獲得一條638 bp 和1631 bp 的基因序列。將序列提交GenBank 并進行序列比對分析后發現，WPC-12 菌株的序列與Fomitopsis palustris 及F.bambusae 序列的相似性分別為99.82%及93.69%?；贗TS 序列同源性構建的WPC-12 菌株系統發育進化樹（圖4）顯示，菌株WPC-12 以100%的支持率與F.palustris 和F.ochracea 菌株共處同一大分枝上，再以100%的支持率與F.ostreiformis 共處同一小分枝。綜合菌株的形態學特征與分子生物學鑒定結果，將WPC-12 鑒定為褐腐菌擬層孔菌屬（Fomitopsis sp.）菌株。

圖4 菌株WPC-11 及WPC-12 腐朽前后黃瑾木材的紅外光譜圖

圖4 木腐真菌WPC-12 的系統進化樹構建

2.3 腐朽真菌的腐朽性能測試

以未經處理的黃瑾木材為試驗材料，對WPC-11 和WPC-12 菌株的腐朽性能進行測試。表2 為黃瑾木材在腐朽試驗前后的質量變化及腐朽12 周后的質量損失率。結果顯示，兩株腐朽真菌均導致木材試樣產生極大的質量損失。在WPC-11 菌株腐朽處理12 周后，木材試樣出現了39.06%的質量損失；而在WPC-12 菌株腐朽12 周后，木材試樣的質量損失率為47.39%，高于菌株WPC-11 腐朽后木材試樣的質量損失率，表明WPC-12 菌株的腐朽能力強于WPC-11。這可能與白腐菌及褐腐菌的作用特點相關，通常褐腐菌對木材的降解速度比白腐菌更快[15]。

表2 黃瑾木材在腐朽試驗前后的質量損失率

圖3 為未經腐朽處理的對照黃瑾木材試樣，及經WPC-11 與WPC-12 菌株處理12 周后黃瑾木材試樣在掃描電鏡下表面及內部形態的圖片。由圖可知，未腐朽木材試樣表面平整光滑，組織結構完整（圖3a）；而經WPC-11 及WPC-12 腐朽后的木材試樣表面破損，片狀完整的木纖維斷裂降解為顆粒狀、碎片狀或條狀形態（圖3c，e）。其中經WPC-12 菌株降解后的木試樣表面的木質纖維幾乎全部被降解為碎顆粒狀（圖3e），表明木材試樣的纖維被WPC-12菌株嚴重破壞，腐朽情況十分嚴重。

木材試樣腐朽前后的內部SEM 圖片也可以清晰顯示未腐朽試樣的內部纖維呈完整的片狀結構，可見排列整齊的纖維紋孔（圖3b）。與之相比，經WPC-11 及WPC-12 菌株腐朽后的木材試樣內壁分布大量菌絲，且菌絲穿透紋孔進入另一相鄰細胞中會進一步侵蝕木質纖維，導致纖維結構出現斷裂、破損或坍塌等跡象，片狀完整的纖維結構被降解為絮狀或絲狀，木材試樣被嚴重破壞及腐朽（圖3d，f）。這一腐朽過程與前人有關木腐真菌對木材微觀結構破壞的闡述一致[16-17]。

a，b: 腐朽前木材試樣的表面（a）及內部（b）SEM 圖；c，d: WPC-11 腐朽12 周后黃瑾木材的表面（c）及內部（d）SEM 圖；e，f: WPC-12 腐朽12 周后黃瑾木材的表面（e）及內部（f）SEM 圖。

2.4 腐朽試樣的FTIR 分析

對腐朽前后的黃瑾木材試樣進行紅外光譜分析，結果如圖4 所示。因木材纖維有機物主要官能團吸收峰多分布在1 800～800 cm-1的區域內，受雜質干擾較小，故通常認為該區域為木材紅外光譜的特征指紋區。與未腐朽對照木材的FTIR 圖譜相比，菌株WPC-11 及WPC-12 腐朽后的木材試樣在1 736 cm-1、1 597 cm-1、1 509cm-1、1463 cm-1、1 424 cm-1、1 330 cm-1、1 268 cm-1及1 125 cm-1等吸收峰處峰值顯著下降或特征峰消失，表明木材試樣中的多種化學組分已被真菌降解。

與未腐朽的木材試樣相比，白腐菌株WPC-11處理后的木材試樣在表征木質素的多個特征峰（1 597 cm-1、1 509 cm-1、1 463 cm-1、1 268 cm-1、1 227 cm-1及1 125 cm-1）處吸收值均出現明顯下降或峰值消失（1 597 cm-1）的情況，而在表征纖維素及半纖維素的特征峰（1 736 cm-1、1 424 cm-1）處下降不明顯或略有下降。897 cm-1為表征多糖類物質中β-1，4-糖苷鍵振動的吸收峰，腐朽后該峰增強表明隨著木質素被大量降解，細胞壁中多糖類物質的含量相對增加。上述結果表明白腐菌主要且優先降解細胞壁中的木質素，而纖維素及半纖維素僅被少量降解，木質素降解是造成腐朽后木材質量、強度和硬度下降的關鍵因素[17-21]。

褐腐真菌WPC-12 腐朽后，可見腐朽試材在表征纖維素和半纖維素特征峰（1 736 cm-1、1 424 cm-1）處的峰值下降比WPC-11 腐朽試材的下降幅度略大，但在表征木質素的系列特征峰（1 597 cm-1、1 509 cm-1、1 463 cm-1、1 268 cm-1、1 227 cm-1、1 125 cm-1）處的下降程度與WPC-11 相比無明顯差異。同時，腐朽試樣表征多糖類物質的897 cm-1與未腐朽試樣相比無明顯變化。這些結果表明褐腐真菌不僅能降解細胞壁中的纖維素和半纖維素，也會大量降解木質素[22-23]，這也與前述WPC-12 菌株腐朽后黃瑾木材試樣質量損失率更高的結果一致。

3 結論

從戶外腐朽的木塑復合材料上，通過分離、純化及培養，分離到兩株腐朽真菌。結合菌株的平板菌落和顯微形態特征以及ITS 序列和18S rDNA 的序列分析比對結果，明確WPC-11 為白腐菌多年臥孔菌屬菌株，WPC-12 為褐腐菌擬層孔菌屬菌株。腐朽性能測試結果表明，二株菌株對黃瑾木材造成了極為嚴重的侵蝕。在腐朽12 周時，WPC-11 和WPC-12 分別對黃瑾木材造成了39.06%及47.39%的質量損失。觀察腐朽后木材試樣的SEM 發現腐朽導致木材表面平整的纖維結構被降解為顆粒狀、碎片狀或條狀，內部則可見菌絲通過紋孔結構侵蝕木質纖維，導致纖維出現了斷裂、破損或坍塌等跡象。FTIR 分析結果表明，腐朽后，木材試樣在表征纖維素、半纖維素和木質素的多個吸收峰處峰值下降，表明木材試樣中的多種化學組分已被腐朽真菌降解。