洗滌產品生產環境與生產工藝的微生物風險分析

楊秀茳，李 東，孫廷麗，劉麗瑜，鄧小鋒，劉永龍*

1.廣東迪美生物技術有限公司,廣東省防霉抗菌工程技術研究中心，廣東 廣州 510535；2.廣東省科學院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測中心，華南應用微生物國家重點實驗室，廣東 廣州 510070

洗滌劑生產工藝簡單，一般在非潔凈環境下進行生產，容易在生產過程中引入微生物，從而形成產品污染風險。廣東省3—5月份氣溫回暖，空氣濕度大，非常適宜微生物的生長繁殖，產品污染的風險也會增加。因此，加強對生產環境、原材料和生產設備的清潔并進行微生物控制以減少產品生產過程中的污染是洗滌劑生產過程中非常重要的環節。為獲取微生物分布的基礎數據、幫助工廠識別微生物風險點并評價防腐體系的有效性，本文對廣東省某洗滌劑廠3—5月的生產環境和生產過程中的微生物風險進行了采樣分析，對污染風險菌進行了分子生物學鑒定并對產品進行了防腐功效測試。通過調查研究，可以掌握生產環境中的微生物分布狀況，幫助工廠識別污染風險點和潛在污染源，避免因大面積污染引起的經濟和社會損失，同時為污染產品的溯源提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

微生物培養基：營養瓊脂培養基（NA）、沙氏瓊脂培養基（SDA），購于廣東環凱微生物科技有限公司；標準菌株：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aerugimosa）ATCC 9027、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC 8739、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538、 洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacian）ATCC 25416、日溝維腸桿菌（Enterobacter gergoviae）ATCC 33028、白假絲酵母（Candida albicans）ATCC 10231、黑曲霉（Aspergillus niger）ATCC 16404、平滑正青霉（Eupenicillium levitum）ATCC 10464，購于廣東省微生物菌種保藏中心；DNA 快速提取試劑盒（D7113-01），購于Magen 公司；防腐劑CJ-2，由廣東迪美生物技術有限公司提供。

1.2 儀器

環凱HKM-II 型空氣浮游菌采樣器（廣東環凱微生物科技有限公司）；滅菌鍋（LDZF-75KB-Ⅱ）；生化培養箱（SHP-250）；超凈工作臺（HDL APPARATUS）；基因擴增儀（ETC 811）。

1.3 試驗方法

1.3.1 生產環境采樣方法

3—5月份按每月一次的頻率分別對某洗滌劑廠的空氣、水樣、原材料、設備表面和包裝材料進行采樣檢測。生產環境的空氣參照《GB 16293-2010 醫藥工業潔凈室（區）浮游菌的測試方法》中的標準；生產用水參照《GB/T 5750.2-2006 生活飲用水標準檢驗方法水樣的采集和保存》中的標準；設備表面和包裝材料采樣方法參照《GB 15979-2002 一次性使用衛生用品衛生標準》中的E2，采樣面積5.0 cm×5.0 cm；采樣結束后按照《化妝品安全技術規范》（2015年版）測定所采樣品的菌落總數[1-4]。

1.3.2 生產過程取樣方法

用無菌取樣瓶對生產過程的每一關鍵步驟重復取樣3 次，于當天、第1 天和第5 天按照《化妝品安全技術規范》（2015年版）進行菌落總數的檢測[4]。

1.3.3 菌種鑒定與最小抑菌濃度（MIC）的測定

將采集到的樣品中分離得到的單菌落進行純化培養后，按照DNA 提取試劑盒的說明書提取污染菌總DNA，利用細菌的通用引物16sRNAF:5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’, 16sRNAR: 5’-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’進行PCR 擴增，擴增條件為: 預熱95℃，4 min，變性94 ℃，50 s，退火54 ℃，40 s，延伸72 ℃，1 min30 s，循環30 次，最后延伸72 ℃，10 min。對擴增序列進行測序，結果通過BLAST 比對分析。同時參照《消毒技術規范》2.1.8.3 的瓊脂稀釋法對該洗滌劑廠所用防腐劑CJ-2 進行最小抑菌濃度（MIC）的測定[5]。

1.3.4 生產成品的防腐挑戰試驗

選擇兩個香型的5 個成品進行防腐挑戰試驗，試驗方法參考美國材料實驗協會標準ASTM E640的防腐功效測試方法[6]。在測試過程中，每個成品分為三份：一份接種標準細菌（大腸埃希氏菌ATCC 8739、金黃色葡萄球菌ATCC 6538、銅綠假單胞菌ATCC 9027、洋蔥伯克霍爾德氏菌ATCC 25416、日溝維腸桿菌ATCC 33028），一份接種標準真菌（白假絲酵母ATCC 10231、黑曲霉ATCC 16404、平滑正青霉ATCC 10464），一份接種污染優勢菌。

2 結果與討論

2.1 生產環境的采樣結果

2.1.1 空氣采樣結果

對該洗滌劑廠的12 個生產區域空氣中的浮游菌含量進行了檢測，結果見表1。檢測結果顯示，12個采樣位點的空氣中均檢測到了浮游菌，特別是在乳化間和生產車間，分別在4月份和5月份檢測到了較多的浮游菌，分別為2 010 CFU/m3和2 030 CFU/m3，其余位點檢測到的浮游菌總數均＜1 000 CFU/m3。參考《化妝品生產企業衛生規范》對生產過程中的空氣質量進行評判，結果表明，制水間、打料間、灌裝間和儲罐區的空氣質量均合格，乳化間和生產車間的空氣質量分別在4月份和5月份檢測為不合格，存在微生物污染風險。建議對兩個風險點的空氣進行紫外燈照射或噴灑霧化消毒劑消毒，并監測消毒效果[7]。

表1 空氣中的浮游菌總數單位：CFU/m3

2.1.2 水樣采樣結果

對該洗滌劑廠的生產用水、過濾膜后水、水儲缸水和打料水進行采樣檢測，結果見表2。結果顯示，3月份有5 個水樣的微生物菌落檢出量在102～103CFU/mL 之間，4月份有2 個水樣的微生物菌落檢出量在104～105CFU/mL 之間，5月份有3 個水樣的微生物菌落檢出量在104～105CFU/mL 之間。參考《化妝品生產企業衛生規范》，生產用水的水質應達到《國家生活飲用水衛生標準》（GB5749-2006）的要求（pH 除外），即菌落總數應小于100 CFU/mL，3 個月份的水樣均存在超標現象，3月份的超標率較高，達62%，4月份和5月份超標率較低，分別為25%和38%。從檢測結果可知，該洗滌劑廠的生產用水存在較大的污染風險，建議加強對水質衛生的監管，交替使用二氧化氯和次氯酸鈉進行定期消毒并監測消毒效果。

表2 生產用水中的微生物檢測結果單位：CFU/mL

2.1.3 設備表面采樣結果

對生產設備的打料缸、配料罐、灌裝線和儲罐的表面進行采樣檢測，結果見表3。檢測結果顯示，10個采樣位點連續3 個月未檢出微生物，說明該洗滌劑廠生產設備表面的衛生狀況良好，污染風險低。

表3 生產設備表面微生物總數 單位：CFU/樣本

2.1.4 原材料與包裝瓶采樣結果

檢測了3 個批次的生產原材料和包裝瓶，見表4。檢測結果顯示，15 個采樣位點均未檢出微生物，說明該洗滌劑廠原材料和包裝瓶的衛生狀況良好，污染風險低。

表4 生產原材料和包裝瓶微生物總數單位：CFU·g-1（原材料）或CFU/樣本（包裝瓶）

2.2 生產過程取樣結果

為找到生產過程中容易引入污染的步驟，從源頭控制產品質量以避免出現風險，對兩種香型的洗滌劑生產過程中的每個步驟分別進行了3 次取樣檢測，分析生產過程中的污染風險點及易感微生物，微生物檢測結果見表5 和表6。

通過表5 和表6 的數據分析，發現兩種香型的洗滌劑產品在加入活性物和助劑的步驟中檢測到微生物，且在放置1 d 和5 d 后的復檢中，微生物呈現迅速繁殖的趨勢。這說明在產品生產過程中，特別是在上述步驟中存在較高的微生物污染風險。同時，結果也提示，在非無菌生產的條件下，兩種香型的配方體系都易受到微生物的影響，因此在生產當天需采取有效的防腐措施，以預防微生物在產品中增殖。結合空氣中偶有微生物超標和芽孢檢出、水樣檢測中頻繁有菌的情況，分析該污染風險可能來源于生產用水、生產罐、生產器具、中轉器具、環境或操作因素，需要加強對生產用水和生產環境的消毒控制，同時加強對生產過程中微生物風險的控制。

2.3 防腐劑及防腐體系的有效性驗證

對取樣檢出的微生物進行了菌種鑒定和MIC測試，結果見表7。研究發現，從風險點共檢出25 株細菌，其中肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌為優勢菌種，分別有9 株和7 株，其余菌種包括煙草腸桿菌3株、無丙二酸檸檬酸桿菌3 株以及粘質沙雷氏菌、食二氮植物桿菌和銅綠假單胞菌各1 株。有趣的是，所有檢測到的菌株對洗滌劑廠所用防腐劑CJ-2 的平均MIC 值均＜0.01%。這一結果表明，該防腐劑在該洗滌劑中表現出高效抑菌活性，且遠低于建議使用量的0.05%～0.1%。因此可以得出結論，環境中的微生物對該防腐劑在該洗滌劑中未表現出耐藥性，顯示出了該防腐劑在維持產品品質和生產環境衛生方面的有效性。

表7 微生物種群鑒定及平均MIC 值

為驗證防腐體系對微生物，尤其是環境中的風險微生物的有效性，我們進行了防腐挑戰試驗，選擇香型Ⅰ洗滌劑的3 個產品和香型Ⅱ洗滌劑的2 個產品進行測試，具體結果見表8。試驗結果表明，這5個產品在面對標準細菌、標準真菌和優勢菌（肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌）的挑戰中，均通過了測試。在添加菌液3 d 后，微生物數量迅速下降至未檢出水平，并在接下來的28 d 內持續保持未檢出狀態。這說明目前工廠采用的防腐體系能夠有效地抵御微生物的侵襲，雖然在生產過程中可能會引入少量微生物，但通過在生產當天立即添加殺菌劑和防腐劑，可以有效殺滅引入的微生物。因此，正確使用防腐劑及防腐體系可以有效控制并降低產品產生繼發性污染的風險。

表8 兩種香型生產成品挑戰試驗結果

3 結論

該洗滌劑廠對生產設備、原材料和包裝材料的微生物污染控制得較好，在微生物檢測中均未檢出，對產品的污染風險較低；對空氣和生產用水的微生物污染控制較差，空氣檢測在4月份和5月份存在超標現象，對產品存在潛在威脅。水樣中檢測出較多的微生物，3 個月份的抽檢中均存在超標現象，檢出量在102～105CFU/mL 之間。水是生產洗滌劑的重要原材料，也是微生物生存繁殖的必要營養物質之一，生產用水中的微生物會直接進入產品且在營養豐富的產品中快速繁殖，對產品有直接污染的風險。因此，要加強對生產用水的微生物控制。對生產過程中每一關鍵步驟的取樣檢測結果顯示，生產過程中的風險點在于加入活性物和助劑的步驟，應重點對其進行控制。從風險點分離鑒定的菌種主要是腸桿菌科的菌種，其中優勢菌為肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌，兩者均為條件致病菌，多引發醫源性感染，臨床上對抗生素的耐藥性日趨嚴重[8-13]。文獻資料顯示，日化用品中也常有肺炎克雷伯氏菌檢出[14-16]，陰溝腸桿菌則較少檢出[17]，兩種菌株均未見對日化常用防腐劑產生耐藥性的報道。檢出菌種對該洗滌劑廠所用防腐劑CJ-2 的MIC 值均＜0.01%，低于實際添加量。對5 個生產成品進行了標準菌株和優勢風險菌株的防腐挑戰試驗，結果均通過了挑戰，結合生產過程的結果進行分析，說明所添加防腐劑的防腐性能良好，可有效防御微生物污染。因此，建議工廠定期開展微生物檢測工作，合理有效地采取消毒預防措施并添加防腐劑，建立有效的防腐體系，全方位控制微生物污染，以減少微生物污染帶來的危害和損失。