中性粒細胞的異質性與腫瘤

葉依依

作者單位：200032 上海 上海中醫藥附屬龍華醫院中醫外科研究所

近年來，隨著免疫療法在癌癥治療應用中突飛猛進，T 細胞、NK 細胞、巨噬細胞、單核細胞等免疫細胞在癌癥生物學中發揮重要作用［1］。中性粒細胞有別于其他免疫細胞，具有非增殖、生存期短等特性。人體發生感染時，中性粒細胞作為天然免疫系統的一線防御，會迅速聚集到感染部位和炎癥組織，執行特定的免疫功能。目前對中性粒細胞的研究多限于感染性疾病，但近期有研究發現，在癌癥背景下，中性粒細胞的生物學行為會發生很大的改變并影響腫瘤進展。本文就中性粒細胞在腫瘤生長和轉移中的生物學作用及臨床應用和靶向中性粒細胞治療癌癥的可能性作一綜述。

1 中性粒細胞的異質性和功能

在正常生理狀態下，中性粒細胞產量高、壽命短，在機體內保持動態平衡。健康人體循環中的中性粒細胞半衰期為5～10 h，此后快速進入自發凋亡［2］。在癌癥背景下，中性粒細胞在骨髓中大量擴增并釋放，其中還包括許多未成熟的中性粒細胞。一旦從骨髓中釋放，中性粒細胞會被CXC 趨化因子受體CXCR2的配體CXCL1、CXCL2、CXCL5 和CXCL8 募集到腫瘤［3］。有證據表明，腫瘤相關細胞因子有助于中性粒細胞存活，癌癥患者中性粒細胞的半衰期延長到17～84 h［4］。ZHU 等［5］分析了黑色素瘤患者的血液樣本，從中鑒別出7 種不同的中性粒細胞亞群，而且這些細胞亞型在體外表現出不同的吞噬能力和活性氧產生能力，在癌癥發生和進展中也承擔不同功能。

中性粒細胞的異質性和功能改變受到多種因素的影響，這些因素包括癌癥、感染、肥胖、壓力及其他慢性炎癥性疾?。?］。癌癥類型與宿主狀態是影響中性粒細胞異質性的決定性條件，但是目前中性粒細胞與腫瘤進展的確切關系仍存在較大爭議。既往研究提出中性粒細胞具有與巨噬細胞類似的極化表型，表現出促腫瘤和抗腫瘤兩種相互矛盾的作用［7］。參照M1/M2腫瘤相關巨噬細胞命名方案，腫瘤相關中性粒細胞的極化表型分為N1 型和N2 型。其中，N1 型（抗腫瘤表型）中性粒細胞的細胞核呈過多分葉狀，具有腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、細胞間黏附分子1、Fas 等因子高表達的特征，它能活化簇分化抗原8（cluster of differentiation 8，CD8）T 細胞，具有很強的體外殺傷腫瘤細胞能力［7］；N2 型（促腫瘤表型）中性粒細胞的細胞核形態多為環狀，它能產生并釋放大量精氨酸酶（arginase，Arg），且高表達CCL趨化因子2［chemokine（C-C motif）ligand 2，CCL2］、CCL5 等因子，耗竭此類細胞能活化瘤內T 細胞，抑制腫瘤生長［7］。雖然N1/N2 型中性粒細胞的概念已經深入人心，但是仍缺乏足夠的證據證明其存在，目前尚無特定的表面標志物可以明確區分。

此外，還有其他描述中性粒細胞不同極化狀態的術語，如多形核粒細胞（polymorphonuclear granulocyte，PMNs）和多形核髓源性抑制細胞（polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells，PMN-MDSCs），以及低密度中性粒細胞（low-density neutrophils，LDNs）和高密度中性粒細胞（high-density neutrophils，HDNs）。在腫瘤生長過程中，PMNs可轉變成病理激活的PMNMDSCs。目前研究認為PMN-MDSCs 的標志物為CD11b+Ly6G+Ly6Clow，主要特征是S100 鈣結合蛋白A8/A9 復合物（S100A8/A9）和髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）高表達［8］。此外，其氧化磷酸化和糖酵解的速率也大幅升高，三磷酸腺苷生成增加，顯示出超強的自發遷移特性［9］。LDNs 和HDNs 根據中性粒細胞的浮力密度不同劃分。循環中的中性粒細胞具有鐘型分布的密度異質性，且這種異質性同時存在于健康和疾病機體中。在正常小鼠體內，超過95%的循環中性粒細胞是HDNs［10］。但在炎癥或腫瘤狀態下，LDNs 占比升高，且隨著腫瘤進展進一步增加；HDNs 則表現出較高水平的吞噬作用，并介導腫瘤細胞毒性，體內過繼轉移HDNs 能顯著延緩早期腫瘤生長［10］。與HDNs 相比，LDNs 產生的活性氧較少，其對內源性趨化肽N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸的反饋更活躍，抗菌能力更強，且能抑制T 細胞增殖［11］。雖然中性粒細胞的極化確切存在，但是這些術語還過于簡單和片面，仍無法通過這些術語準確地區分中性粒細胞的生理、病理狀態及功能。無論如何，由微環境驅動的腫瘤相關中性粒細胞的功能差異幾乎是確定的，充分了解這類細胞與周圍環境之間的相互作用有助于更好地了解腫瘤生長和轉移過程。

2 中性粒細胞的抗腫瘤作用

2.1 T細胞依賴性抗腫瘤

通常情況下，中性粒細胞的抗腫瘤作用是通過促進T 細胞活化殺傷腫瘤來實現的。SINGHAL 等［12］在肺癌早期患者體內發現一類具有抗原提成細胞特征的中性粒細胞亞群，其通過TNF 配體超家族成員4（TNF ligand superfamily member 4，TNFSF4）、TNFSF9、CD86、CD54 等分子提供共刺激信號，從而增強抗原非特異性和腫瘤特異性T 細胞反應。PONZETTA 等［13］發現活化的中性粒細胞可驅動腫瘤微環境中CD4-CD8-非常規αβ T 細胞產生IFN-γ，抑制3-甲基膽蒽（3-methylcholanthrene，3-MCA）肉瘤的生成。但是，中性粒細胞的T 細胞活化效應只存在于腫瘤早期階段，隨著腫瘤的進展，這種效應也隨之減弱［14］。除了中性粒細胞本身外，中性粒細胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）也能激活T細胞。NETs是由活化的中性粒細胞釋放的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）-組蛋白復合物和蛋白質組成的網狀結構，它能與T 細胞上的Toll 樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2）相互作用，誘導轉錄激活蛋白3磷酸化，促進輔助性T細胞17分化［15］。

2.2 非T細胞依賴性抗腫瘤

中性粒細胞還可以通過非T 細胞依賴的方式發揮抗腫瘤作用。譬如，中性粒細胞可以通過釋放活性氧、過氧化氫、TNF-α、一氧化氮合酶等直接誘導癌細胞死亡［16-18］。CUI 等［19］發現彈性蛋白酶ELANE 是人源中性粒細胞釋放的主要抗癌蛋白，其可通過蛋白水解釋放CD95死亡結構域殺傷多種癌細胞。另有研究發現，中性粒細胞通過促進癌細胞從子宮內膜的基底膜分離、脫落和死亡，延緩早期子宮內膜癌小鼠的惡性進展［20］。此外，中性粒細胞還能通過調節腸道菌群的平衡抑制腸癌。TRINER 等［21］發現中性粒細胞下調白細胞介素17（interleukin 17，IL17），能減少腫瘤相關細菌的擴增和腫瘤相關炎癥，抑制結腸癌的增殖和侵襲。中性粒細胞也能直接殺傷腫瘤細胞，過程與其抗感染類似。中性粒細胞利用免疫球蛋白G Fc受體，通過抗體依賴性細胞毒作用（antibody-dependent cellular toxicity，ADCC）直接識別和吞噬癌細胞［22］。

綜上所述，目前盡管中性粒細胞的抗腫瘤作用報道相對較少，但可以發現，中性粒細胞的抗腫瘤作用多報道在腫瘤發展的初期階段。在這個時期，中性粒細胞被腫瘤影響，但仍保留抗腫瘤功能，其主要通過激活適應性免疫、釋放細胞毒性介質、啟動ADCC 過程發揮抗腫瘤效應（表1）。

表1 中性粒細胞的抗腫瘤作用及機制Tab.1 Anti-tumor effects of neutrophils and their mechanisms

3 中性粒細胞的促腫瘤作用

3.1 誘導炎癥發揮促腫瘤作用

中性粒細胞的促癌作用與炎癥有著密不可分的關系，可以說中性粒細胞是炎癥與癌癥之間聯系的重要介質。一項納入近50 萬名成年受試者的前瞻性隊列研究發現白細胞數量與肺癌發病風險呈正相關，而且這種關聯主要是由中性粒細胞數量增加驅動［23］。COFFELT等［24］證實“γδ T細胞-IL17-中性粒細胞軸”參與乳腺癌轉移過程。該研究檢測到Trp53F/F乳腺癌自發性轉移小鼠血清中IL17A和粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）水平升高，進一步研究發現腫瘤誘導γδ T細胞分泌大量的IL17A，而IL17A 可刺激G-CSF 高表達，從而驅動中性粒細胞的擴增和表型改變（cKIT+細胞比例增加），進而促進肺轉移。此外，肥胖相關炎癥以粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和IL-5 依賴的方式誘導肺部中性粒細胞聚集，然后上調Cxcr2、Tlr4、S100a8、S100a9、5-脂氧合酶、還原型輔酶Ⅱ氧化酶2、前列腺素內過氧化物合酶2 等與中性粒細胞動員、活化、免疫抑制相關的基因，促進乳腺癌肺轉移［25］。還有研究報道，腫瘤相關中性粒細胞可特異性上調脂肪酸轉運蛋白2，使花生四烯酸加工成前列腺素E2，從而增強其促腫瘤免疫抑制特性［26］。

3.2 促進轉移前生態位建立發揮腫瘤作用

早在一個世紀前，英國外科醫生Stephen Paget 就提出了腫瘤轉移的“種子與土壤”學說，該學說奠定了“轉移前生態位”的基礎。近幾十年來，“轉移前生態位”的學術理念得到了進一步完善。轉移前生態位有利于腫瘤細胞的定植、存活、生長，而中性粒細胞是其中的關鍵組分。目前科學家們已經達成共識，認為中性粒細胞的積聚有助于遠端器官的免疫抑制和細胞外基質重塑，促進轉移前生態位建立［27］。WCULEK等［28］研究報道中性粒細胞是乳腺癌小鼠肺轉移前生態位建立的主要成分和驅動因素，其衍生的白三烯通過選擇性地擴增保留高致瘤潛力的癌細胞從而幫助其在遠端組織定植。其中，原發腫瘤衍生物--腫瘤源性外泌體和腫瘤衍生因子是轉移前生態位形成的“元兇”。腫瘤源性外泌體RNA 激活肺上皮細胞中的TLR3，誘導趨化因子分泌并促進中性粒細胞募集，這對肺轉移生態位的形成至關重要［29］。另外，卵巢癌的嗜網膜性也是由于卵巢腫瘤衍生的炎癥因子刺激中性粒細胞動員和NETs 的釋放，形成轉移前網膜生態位，從而有助于卵巢癌細胞在網膜中定植［30］。腫瘤衍生因子還可誘導肺成纖維細胞p38α 激酶的激活，在肺轉移前生態位的形成和隨后的肺轉移中起關鍵作用［31］。而其機制是活化的p38α激酶上調成纖維細胞活化蛋白，促進趨化因子分泌，然后聚集大量中性粒細胞浸潤肺部，從而形成轉移前生態位。

3.3 釋放NETs促進腫瘤進展

NETs 水平升高與多種類型癌癥的進展均呈正相關［30，32-33］。NETs 能直接促進癌細胞增殖、滲出、遷移和侵襲，還能通過推動腫瘤惡性生物學過程、激活休眠癌細胞、參與轉移前生態位形成等促進腫瘤的生長和轉移［34-36］。在肺轉移中，NETs 的作用尤為突出。有研究報道，持續的肺部炎癥可誘導休眠的癌細胞周圍區域形成NETs，NETs 的中性粒細胞彈性蛋白酶NE、基質金屬蛋白酶9 與層黏連蛋白相互作用，喚醒肺臟中的休眠癌細胞，誘導乳腺癌復發轉移［37］。中性粒細胞的一種亞型--腫瘤相關衰老中性粒細胞在早期乳腺癌的肺臟中蓄積，形成轉移前生態位，促進肺轉移［38］。其機制是腫瘤分泌的煙酰胺磷酸核糖基轉移酶上調中性粒細胞的轉錄因子去乙?；?，促進線粒體通透性過渡孔通道開放，釋放線粒體DNA，誘導線粒體依賴的NETs 形成，而NETs 捕獲循環腫瘤細胞促進肺轉移。

NETs 與凝血功能的相關性也突出了NETs 在癌癥中的重要性。JUNG 等［39］發現胰膽管惡性腫瘤患者血漿中高水平的NETs 標志物--組蛋白-DNA 復合物和游離雙鏈DNA 與高水平的內源性凝血酶生成潛力存在相關性。在MMTV-PyMT 乳腺癌小鼠和C57/Bl6 原位胰腺癌小鼠模型中，NETs 通過激活血小板或釋放組織因子促進凝血引發癌癥相關血栓［40-41］。NETosis，即NETs 的釋放，是中性粒細胞的炎性死亡方式，阻斷該過程能有效預防血栓的形成［42］。據報道，各種引發全身性炎癥損傷的因素，包括脂多糖、煙草煙霧、腫瘤衍生的炎癥細胞因子和手術應激等都會誘導NETosis，進而促進癌癥患者疾病進展［32］。因此，調控NETosis 可能為抗癌癥血栓形成提供新的靶點，甚至可能有助于控制癌癥本身。

3.4 其他促腫瘤作用途徑

除了以上促腫瘤機制，GONG 等［43］發現荷瘤鼠的中性粒細胞表達更高水平的免疫抑制相關基因，如Ptgs2、IL1β、IL10、Arg1、Arg2等，表現出強大的抑制T細胞增殖和殺傷NK 細胞的免疫抑制特性，在過繼T細胞治療中會抑制T 細胞功能，導致過繼細胞療法失敗。YEE 等［44］發現中性粒細胞通過鐵死亡誘導腫瘤壞死，加速惡性膠質母細胞瘤進展。腫瘤組織內部的早期壞死會誘導大量中性粒細胞浸潤，其通過鐵死亡殺傷腫瘤細胞，造成更多的腫瘤壞死，如此惡性循環加速膠質瘤進一步惡化。除此之外，中性粒細胞甚至能作為腫瘤轉移的能量儲存庫。有研究報道，在乳腺癌發生轉移前，肺間充質細胞以前列腺素E2 依賴性和非依賴性方式抑制中性粒細胞中脂肪甘油三酯脂肪酶的活性，誘導中性粒細胞積累脂質，這些脂質通過巨胞飲-溶酶體途徑轉運到轉移的腫瘤細胞中，賦予腫瘤細胞更強的存活和增殖能力［45］。

總之，隨著腫瘤的進展，在腫瘤及腫瘤微環境的持續影響下，中性粒細胞可向免疫抑制表型轉換。這個時期的中性粒細胞可分泌或表達更高水平的炎癥因子、血管生成因子、免疫抑制因子，它們通過誘導炎癥、釋放NETs、誘導免疫抑制、促進血管生成、強化腫瘤惡性行為等過程促進腫瘤進展（表2）。

表2 中性粒細胞的促腫瘤作用及機制Tab.2 Tumor-promoting effects of neutrophils and their mechanisms

4 中性粒細胞相關指標的臨床應用探索

4.1 中性粒細胞-淋巴細胞比值（neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR）

NLR 已被證實是多種類型癌癥患者的獨立預后因素［1，46］。一項包含316 例乳腺癌患者的回顧性研究評估了NLR 預測患者死亡率的有效性，結果發現NLR＞3.3 是乳腺癌患者近期和遠期死亡的獨立預測因素［47］。CUPP 等［48］評估了NLR 與癌癥預后之間關聯證據的強度和有效性，結果發現NLR升高與癌癥患者的不良預后存在關聯，特別是在前列腺癌、非肌肉侵襲性膀胱癌和鼻咽癌中，NLR 和總生存期（overall survival，OS）之間的關聯證據最有力。此外，還有研究報道NLR≥4 的非小細胞肺癌患者接受免疫治療后死亡風險增加［49］。值得注意的是，盡管中性粒細胞在癌癥不同時期具有顯著異質性，但在大部分實體瘤中，NLR 升高只與不良結局相關，無論是在癌癥早期還是晚期。綜上認為，NLR 作為癌癥預后的生物標志物展現了較好的臨床應用前景，但是其與部分類型癌癥的預后關聯仍存在不確定性，并且不同研究對于高NLR 閾值的定義也不相同，需要進一步研究提供更加強有力的證據評估NLR 與癌癥的因果關系并測試其臨床效用。

4.2 NETs

在一組接受轉移性結直腸癌肝切除術的患者隊列中，術后NETs 的增加與無病生存期（disease-free survival，DFS）降低相關，因此認為NETs 與手術應激后肝轉移的發展有關，消除NETs 可能有助于降低腫瘤復發風險［50］。另一項研究發現，乳腺癌和結腸癌患者的肝轉移灶中存在大量NETosis，血液中NETs 水平的升高可用于預測早期乳腺癌患者肝轉移風險［51］。YAZDANI 等［52］在27 例接受結直腸根治術的患者中發現高水平血清MPO-DNA（NETs 形成標志物）與更短的DFS和OS顯著相關。

如上所述，NETs 與血栓形成具有相關性，因此NETs 檢測技術的開發與應用可能對癌癥相關血栓的預測更有意義。MAURACHER 等［53］檢測了984 例癌癥患者血漿中NETs 的生物標志物循環游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）、核小體和瓜氨酸組蛋白H3（citrullinated histone H3，CitH3）的水平，其中89例患者在2 年隨訪中發生靜脈血栓栓塞，其中肺癌和胰腺癌患者血漿的CitH3水平與靜脈血栓栓塞表現出很強的相關性，乳腺癌患者有邊緣性相關性，而腦癌或結直腸癌患者沒有相關性。另外一項納入957 例患者的前瞻性隊列研究發現CitH3、cfDNA 和核小體水平與腫瘤患者動脈血栓栓塞癥的風險無關，但是與癌癥患者死亡率呈正相關［54］。

NETs 作為癌癥生物標志物已成為共識，未來靶向NETosis 的臨床治療方案或將成為可能。CitH3 和CitH3-DNA 復合物是NETs 的最佳生物標志物。MPO-DNA 復合物也是較好的NETs 生物標志物，但仍存在非特異性現象［55］。目前，溶解NETs 藥物，如肝素和DNA 酶Ⅰ（deoxyribonuclease Ⅰ，DNase Ⅰ）等，已經在臨床使用。肽基精氨酸脫亞氨酶4 是NETs 形成必需的蛋白，其特異性抑制劑也在開發中。雖然前景光明，但是到目前為止，靶向NETs的基礎和臨床研究主要是以感染性疾病和自身免疫疾病為主，NETs 作為癌癥治療靶標的有效性及安全性仍需要更多的確鑿證據。

4.3 中性粒細胞絕對計數

較高的腫瘤相關中性粒細胞絕對計數往往預示不良的疾病預后［56］。有研究報道中性粒細胞絕對計數與肝內膽管癌的不良無復發生存期和癌癥特異性生存率相關，可用于預測疾病復發［57］。SONG等［58］分析了食管鱗癌患者圍手術期中性粒細胞計數與OS 的關系，發現中性粒細胞計數≥2.6 是OS 的獨立預后指標。但是，目前中性粒細胞的絕對計數與癌癥預后的相關性存在很大爭議，它們之間的關聯證據受研究質量、異質性、小樣本效應的限制，需要進一步研究打破現有證據的局限性。

目前絕大多數中性粒細胞的表型和功能研究是在動物模型中進行，而關于癌癥患者體內研究證據非常有限。盡管許多研究已經證實中性粒細胞在癌癥進展中的作用，但中性粒細胞如何作為靶標應用于腫瘤不同階段的免疫療法仍沒有明確答案，需要進一步探索。

5 小結

近年來的研究揭示了中性粒細胞在腫瘤發生、生長、轉移、血管生成、腫瘤相關血栓形成、免疫抑制等方面的重要作用，展現了腫瘤相關中性粒細胞的可塑性和異質性，以及其作為癌癥診斷生物標志物和治療靶點的潛力，靶向中性粒細胞的治療方式與現有的抗腫瘤治療方式相結合可能是有效、安全的癌癥治療策略。但是，鑒于中性粒細胞在人體中的復雜性，未來仍需更多的研究和數據才能確定調節腫瘤相關中性粒細胞表型和功能的生物標志物及其作用機制。