基于網絡藥理學和分子對接探討虎杖調控鐵死亡治療動脈粥樣硬化作用機制*

趙夢涵,俞 琦

(貴州中醫藥大學,貴州 貴陽 550025)

近年來,隨著人口老齡化逐年增加,腦卒中、冠心病等心血管疾病的患病率和死亡率持年上升,已位于死因譜的前列,同時也是造成死亡和疾病的首要病因[1]。動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是冠心病的主要病理改變,是一種由脂質蓄積所導致的動脈內膜炎癥性疾病[2]。在AS病變過程中,大量氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)聚集在受損血管內膜,產生細胞毒性,使內皮細胞、平滑肌細胞等多種細胞損傷,導致細胞死亡,從而加速AS發展[3]。鐵死亡是一種受調控的促炎性的細胞死亡方式,主要與谷胱甘肽(GSH)的消耗、脂質的過氧化和鐵代謝異常密切相關[4]。AS發生時,細胞內鐵離子聚集導致鐵過載,鐵離子通過Fenton反應造成活性氧(ROS)堆積,使細胞氧化性死亡。研究表明,鐵沉積是晚期動脈粥樣硬化斑塊的重要特征,鐵過載可促進氧化應激、脂質過氧化等進程,增加斑塊的不穩定性[5]。

研究證實,虎杖及其主要活性成分在抗AS發生和發展中發揮重要作用?；⒄染哂星鍩峤舛?、利濕祛風、活血散淤(破血祛淤)等功效,主治腹瀉、發熱、濕熱黃疸[6]?；⒄戎饕絮?、黃酮類、二苯乙烯類化合物[7]?，F代藥理學研究表明,虎杖在抗炎、抗血栓、抗氧化、保護心肌、抗腫瘤等方面表現出良好的藥理作用[8]?；⒄瓤梢哉{節AS模型兔的脂質代謝,抑制血管平滑肌細胞增殖及抗炎機制綜合發揮抗AS的作用[9]。同時,虎杖及其主要活性成分也可以調節鐵代謝?；⒄戎械幕钚猿煞珠纹に?、白藜蘆醇可以抑制Fe2+積累和ROS的產生,保護鐵死亡關鍵標志物GSH與谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)活性,降低脂質過氧化,從而抑制鐵死亡的發生[10-11]。迄今為止,尚未闡明虎杖抑制鐵死亡治療AS的作用機制。

網絡藥理學可獲取數目龐大、結構多樣的生物信息,有利于中醫藥現代化的發展。本研究利用網路藥理學,篩選虎杖的主要成分與靶點,系統研究“虎杖成分-靶標-疾病-通路”的網絡關系,為虎杖治療AS的臨床推廣提供實驗基礎,同時為系統了解鐵死亡在AS中扮演的重要角色提供依據。

1 材料與方法

1.1 虎杖化合物的篩選和靶點預測

利用中藥系統藥理學數據庫及分析平臺TCMSP(https://tcmspw.com/),以虎杖為關鍵詞檢索其所有化學成分。根據藥物在體內的動態變化,對虎杖的活性成分按口服生物利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18來篩選虎杖的藥效物質及相應靶點。其中活性成分虎杖苷和白藜蘆醇的OB值和DL值未能通過初篩,但林園園[12]、李世環[13]研究發現虎杖苷和白藜蘆醇有抗AS的作用,因此將其列入其中。在Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)選取人源基因,限定物種為“human”,對靶蛋白進行匹配,將靶蛋白名稱轉換成對應的基因名稱。

1.2 動脈粥樣硬化相關靶點預測

在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)和Drugbank數據庫(https://go.drugbank.com/)輸入關鍵詞“atherosclerosis”,查找相關的靶點基因。若靶點太多,根據Score值≥中位數的方法,篩選出適當的基因,保留靶點Score值高的,值越高說明靶點與疾病關系越密切。將虎杖活性成分靶點集與AS靶點集分別輸入Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)中獲取交集靶點,即為虎杖治療AS的潛在靶點。

1.3 “藥物-活性成分-靶點”網絡構建

運用Cytoscape 3.9.1軟件構建虎杖有效成分-交集靶點網絡圖。

1.4 虎杖對動脈粥樣硬化的PPI網絡分析

將得到的交集靶點蛋白導入到STRING 數據庫(http://string-db.org/cgi/ input.pl),選擇物種為“Homo sapiens”,獲得蛋白間相互作用信息,構建蛋白互作網絡(protein-protein interaction network,PPI),再將其導入Cytoscape 3.9.1 軟件進行可視化處理。

1.5 基因富集分析

將公共靶點導入Metascape數據庫(https://metascape.org/)對虎杖治療 AS 的相關靶點進行 GO 富集和 KEGG 通路富集分析,將分析結果導入微生信(https://bioinformatics.com.cn/)生成GO柱狀圖和KEGG氣泡圖。

1.6 鐵死亡調控基因獲取及與虎杖、動脈粥樣硬化3者靶點綜合分析

在GeneCards 數據庫和FerrDb數據庫,查找與鐵死亡相關的靶標基因。將鐵死亡的靶標基因和上述虎杖與AS的交集靶點輸入到Venny2.1.0中,提取其公共靶點,為虎杖調控鐵死亡治療AS的靶點。將公共靶點導入STRING 數據庫,構建PPI網絡,導入Metascape 數據庫進行KEGG 通路富集分析。

1.7 分子對接驗證

在PubChem 數據庫(https://pubchem.Ncbi.nlm.nih.gov /)中查找虎杖調控鐵死亡抗AS主要成分的三維結構,并使用Chem3D進行能量最小化,作為分子對接的小分子配體。將虎杖調控鐵死亡抗AS公共基因中Degree排在前3位基因輸入在 UniProt 數據庫中,篩選公共基因所對應蛋白質 ID,限定物種為“human”,PDB 蛋白數據庫中輸入蛋白質ID 獲得蛋白質的三維結構,作為分子對接的大分子受體。利用SYBYL-X 2.0軟件對受體去水、加氫、修復側鏈后和配體進行對接。

2 結果

2.1 虎杖有效成分及靶點篩選

在TCMSP數據中共得到虎杖62個化學成分,根據OB≥30%且DL≥0.18,共得化合物10個,靶點324個,將這324個靶點導入Uniprot數據庫,去除無靶點者和刪去重復項,加上虎杖苷和白藜蘆醇,得到化合物10個,靶點252個。為方便后續研究,將化合物分別編號HZ1～HZ10,具體信息見表1。

表1 虎杖活性成分信息

2.2 虎杖與動脈粥樣硬化交集靶點的篩選

以“atherosclerosis”為關鍵詞,在GeneCards 數據庫和Drugbank數據庫進行檢索,篩去Score值低的,共得AS直接靶點1328個。利用Venny 圖在線工具分析AS靶點與虎杖有效活性成分對應靶點的共有部分,獲得虎杖對抗AS的 146個預測作用靶點。見圖1。

圖1 虎杖活性成分靶點與動脈粥樣硬化交集靶點

2.3 “虎杖-活性成分-交集靶點”網絡構建

利用Cytoscape 3.9.1軟件構建虎杖-有效活性成分-交集靶點網絡。圖2中,圈中間的為虎杖,圈的節點代表虎杖有效活性成分,三層方塊圈為交集靶點,邊線代表虎杖活性成分與交集靶點的相互聯系。見圖2。

圖2 虎杖“藥物-成分-靶點”網絡圖

2.4 PPI網絡的構建

將交集靶點導入STRING數據庫,設置人源物種,獲得靶標相互作用關系,設置置信度為0.9,隱藏斷開節點靶點,得到PPI網絡圖,其中包含146個節點,692條邊。將PPI網絡圖導入到Cytoscape軟件進行優化,然后使用CentiScaPe 2.2 Menu插件進行篩選,Degree Centrality為10.134,Betweenness Centrality為232.7164,Closeness Centrality為0.0028,以AKT1、MAPK3、JUN、STAT3、MAPK1為度值前5靶點。見圖3。

圖3 虎杖抗動脈粥樣硬化作用靶點PPI網絡圖

2.5 KEGG通路分析與GO富集

將虎杖抗AS的146個潛在靶點導入Metascape數據庫,GO富集結果中,生物過程(Biological process,BP)有1973條,細胞組成(cellular component,CC)有76條,分子功能(molecular function,MF)有156條。根據富集結果顯著性較強的前10位,導入到微生信在線工具平臺,做出柱狀圖。見圖4。獲取KEGG通路的富集共有189條通路,根據富集結果,顯著性較強的前20位導入到微生信在線工具平臺,做出氣泡圖。見圖5。

圖4 GO生物學功能富集結果

圖5 KEGG信號通路

2.6 鐵死亡調控基因獲取及與虎杖、動脈粥樣硬化3者靶點綜合分析

以“ferroptosis”為關鍵詞,在GeneCards 數據庫和FerrDb數據庫檢索,共得鐵死亡直接靶點887個。將鐵死亡靶標與上述146個公共基因輸入Venny圖在線工具分析中,獲得44個公共靶點。這44個基因既是虎杖作用靶點,也是抗AS的靶點,同時也是鐵死亡調控基因。如圖6。將這44個公共靶點導入 STRING 數據庫,獲得PPI網絡圖,在Cytoscape 軟件進行優化,度值前三的靶點為TP53、JUN、IL-6。如圖7。對這44個靶點進行KEGG通路分析,根據富集結果,顯著性較強的前20位導入到微生信在線工具平臺,做出氣泡圖,富集較強的為MAPK信號通路。見圖8。

圖6 虎杖調控鐵死亡抗動脈粥樣硬化交集靶點

圖7 虎杖調控鐵死亡抗動脈粥樣硬化靶點PPI網絡圖

圖8 虎杖調控鐵死亡抗動脈粥樣硬化KEGG信號通路

2.7 分子對接

為了驗證虎杖調控鐵死亡抗AS,最后對分子對接進行研究。受體選用上述44個公共靶點的前3個,即TP53(PDB ID:1TUP)、JUN(PDB ID:1JNM)、IL-6(PDB ID:4CNI)。配體選用虎杖10個關鍵中藥成分。在進行對接時,以總打分值(Total Score)≥ 5為篩選條件篩選對接結果較好的化學成分,總打分值越高說明結合較為穩定。對接結果中,TP53和IL-6有4個活性成分的Total Score>5,JUN有3個活性成分的Total Score>5,1個活性成分Total Score>4。對接評分如圖9。最后對接結果較好的化學成分和蛋白晶體進行可視化。如圖10。

圖9 分子對接結果

圖10 分子對接可視化

3 討論

研究表明,AS致病機制較為復雜,經過大量的研究,目前存在的學說有炎癥反應學說、脂質代謝學說、糖尿病學說、氧化應激學說等[14-16]。對AS準確預防和治療尚不明確。鐵死亡的主要機制與GSH/GXP4抗氧化系統活性、脂質過氧化程度、鐵代謝等多個途徑有關,并且參與AS多個病理過程,成為研究AS的新靶點[17]。中草藥的功效是多靶點、多途徑、多種活性物質共同作用的結果,在調控鐵死亡中有獨具優勢。網絡藥理學具有系統性和整體性的特點,通過“多成分-多靶點-多通路”相互作用網路來分析中草藥的復雜性[18],為臨床防治提供理論依據。本研究首次將鐵死亡與網絡藥理結合,通過藥物靶點-疾病靶點及鐵死亡相關靶點三者結合取交集,同時結合分子對接技術驗證藥物成分與AS鐵死亡靶點結合能力,從鐵死亡角度進一步證實虎杖治療AS的部分分子機制。

通過在數據庫的檢索,篩選出10個有效活性成分和146個抗AS作用靶點,最終得到虎杖抗AS的重要活性成分——白藜蘆醇和槲皮素。這146個靶點再與鐵死亡調控基因分析,得到44個公共靶點,而 TP53、JUN與IL-6是AS鐵死亡過程中的主要靶點。研究顯示,越來越多的基因被發現可以調控鐵死亡的進程,其中這三位關鍵靶點也包含其中。研究報道,TP53是鐵死亡中的樞紐基因[19]。TP53基因調控細胞死亡模式,影響氧化還原狀態,從而改變代謝過程和對鐵死亡的反應[20]。何信用[21]等研究發現,TP53激活鐵死亡的病理過程,谷胱甘肽(GSH)合成降低,引起GPX4活性降低,抗氧化能力降低,ROS升高,誘發細胞死亡,導致氧化損傷,加劇AS病情發展。IL-6在驅動鐵死亡表達中起著關鍵作用[22]。Yang[23]等研究發現,通過NF-κB途徑誘導IL-6,增加血清鐵濃度和轉鐵蛋白飽和度的表達,增加了鐵死亡。Zheng[24]等研究表明,經過體內驗證得出,JUN是鐵死亡的相關靶點和生物標記物,并可作為預防心血管事件的重要靶點。研究報道,白藜蘆醇顯著降低血清與胸主動脈中IL-6水平,減緩炎癥反應,從而減輕AS的發展[25]。同時,白藜蘆醇誘導TP53蛋白水平增加,加強 TP53基因的啟動子活性[26]。研究發現,槲皮素抑制脂多糖誘導炎癥動物模型中JUN和IL-6蛋白水平的上調,減輕炎癥反應[27]。TP53、IL-6、JUN靶點可能與AS的鐵死亡發生發展密切相關,而白藜蘆醇和槲皮素可能抑制這些基因在AS的表達發揮治療作用。

通過KEGG富集分析結果顯示,MAPK信號通路在AS的鐵死亡中至關重要。Mu[28]等研究發現,細胞發生鐵死亡后,能激活炎性信號通路,增加炎癥反應,調節鐵代謝可以改變T細胞、B細胞等免疫細胞功能,控制炎癥發生。因此,鐵死亡和炎癥也有密切關系。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是信號從細胞外向細胞核傳遞途徑之一,包括P38MAPK、ERK和JUN信號通路,參與炎癥信號傳導,并響應各種細胞內和細胞外刺激(包括氧化應激),細胞凋亡等多種病理生理過程,與AS“炎癥學說”發病機制最為密切[29]。Zhao[30]等研究發現,AS模型的大鼠中通過促進P38、ERK、JUN表達,激活MAPK信號通路,加重AS癥狀,該發現與本文所得出研究結果相符。另外,槲皮素降低促炎因子的表達,如IL-6和IL-17A,抑制TNF-α誘導MAPK通路激活[31]。Meng[32]等研究發現,槲皮素可以提高抗氧化能力并抑制磷酸化MAPK和NF-κB的表達。

虎杖可能通過槲皮素和白藜蘆醇介導MAPK信號通路,減緩AS的鐵死亡炎癥反應。白藜蘆醇也可消除大鼠血清ROS水平升高,下調HIF-1α蛋白表達,抑制MAPK通路,減緩炎癥反應[33]。因此,虎杖可能通過槲皮素和白藜蘆醇介導MAPK信號通路,減輕AS的鐵死亡炎癥反應。

本研究將關鍵活性成分和核心靶點對接在分子水平,結果表明,槲皮素和白藜蘆醇能夠與TP53、JUN、IL-6成功對接,總分在5.0以上,表明關鍵成分于靶標具有較強的結合力。

4 結論

綜上所述,利用網絡藥理學系統對虎杖調控鐵死亡治療AS的作用機制進行研究,發現槲皮素和白藜蘆醇作為虎杖有效活性成分,可通過TP53、IL-6、JUN等靶點,介導 MAPK信號通路,從細胞鐵死亡途徑證明虎杖改善AS癥狀,并通過分子對接進行了驗證,也為下一步實驗驗證提供參考。