微管不穩定蛋白-1在肛門鱗狀上皮內瘤變分級診斷中的應用價值

楊春, 石娜, 王康, 王春

1.東南大學醫學院附屬南京同仁醫院消化內科,江蘇南京 211102;2.南京市中醫院病理科,江蘇南京 210006;3.東南大學醫學院附屬南京同仁醫院普外科,江蘇南京 211102

肛門鱗狀上皮內瘤變(anal intraepithelial neoplasia,AIN)是肛門鱗狀細胞癌的癌前病變。根據疾病的分級,AIN 1級為低級別鱗狀上皮內瘤變,AIN 2級和AIN 3級為高級別鱗狀上皮內瘤變,因為高級別鱗狀上皮內瘤變存在進展為浸潤癌的較大風險,所以早期篩查AIN并判斷分級對指導AIN治療具有重要意義[1-2]。與宮頸上皮內瘤變具有成熟的篩查系統不同,目前AIN尚缺乏統一的篩查和分級診斷體系,因此,發現AIN相關的分子標志物有助于AIN的診斷和分級。微管不穩定蛋白-1(stathmin-1,STMN1)在有絲分裂過程中發揮重要作用,通過阻止微管的組裝和促進微管的拆卸來促進細胞運動和遷移[3]。有研究顯示,STMN1高表達與乳腺癌、卵巢癌、結直腸癌等惡性腫瘤的發生發展密切相關,也參與宮頸上皮內瘤變的發生發展[4-5],但STMN1在AIN中的表達變化及意義尚不清楚。因此,本研究對STMN1在不同級別AIN中的表達變化及其對分級診斷的應用價值展開探索?，F報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月1日—2021年10月1日南京市中醫院經病理確診的AIN標本33例為AIN組,病理科保存的肛門移行區正常黏膜標本10例為對照組。兩組一般資料比較差異無顯著性(P>0.05;表1)。納入標準:①參照《肛門上皮內瘤變診治中國專家共識》[6],經病理診斷為AIN;②未接受過腫瘤相關治療;③患者或家屬知情同意,簽署知情同意書。排除標準:①合并心肝腎等重要臟器功能不全;②合并代謝性疾病、惡性腫瘤;③臨床資料不全。

表1 不同p16、Ki-67表達AIN組織STMN1 mRNA表達水平和陽性表達率的比較

1.2 AIN分級評估[6]

AIN鏡下病理表現為細胞核異型性,包括核增大、染色質增粗、核膜不規則,以及基底層以上核分裂像的出現。AIN 1級:未成熟細胞數量局限在上皮層厚度下1/3;AIN2級:未成熟細胞增殖累及上皮層厚度1/3～2/3;AIN3級:未成熟細胞累及上皮層厚度上1/3。AIN 1級為低級別鱗狀上皮內瘤變,AIN 2級和3級為高級別鱗狀上皮內瘤變。

1.3 免疫組化檢測STMN1、p16、Ki-67陽性表達

各組組織經4%多聚甲醛固定,石蠟包埋后4 μm切片,采用EnVision二步法進行免疫組化染色。所用一抗Stathmin-1、p16、Ki67及二抗均購自福州邁新生物技術有限公司。Stathmin-1著色于細胞質,僅在上皮基底層染色時為陰性,在上皮基底和中間細胞層呈現彌漫染色時為陽性。p16著色于核及胞質,當組織呈空白或斑片狀染色時為陰性,當鱗狀上皮基底和中間細胞層呈現彌漫染色,伴或不伴淺表細胞層染色時為陽性。Ki-67著色于細胞核,基底層散在染色為陰性;上皮下1/3、下2/3或超過2/3染色為陽性。

1.4 熒光定量PCR檢測STMN1 mRNA表達

采用RNA提取試劑盒提取組織樣本RNA,將RNA反轉錄為cDNA,而后配置熒光定量PCR檢測體系如下:cDNA 1 μL、反應混合液10 μL、上下游引物溶液各0.6 μL,去離子水補足至20 μL。STMN1上游引物5′-AGCGACGTTGATGACGAT-3′,下游引物5′-ATGCTAGCTAGCTAGCTG-3′。β-actin上游引物5′-GCTAGCTGAAGCTAGCGA-3′,下游引物5′-GCTAGGCTAGTTCGATGCA-3′。熒光定量PCR反應程序如下:95 ℃ 10 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,重復40個循環。反應完成后得到循環曲線及循環閾值(Ct),以β-actin為內參,測定STMN1 mRNA表達水平。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 AIN組和對照組STMN1表達的比較

對照組STMN1在上皮基底層陽性表達,AIN組STMN1在上皮基底和中間細胞層呈現彌漫染色(圖1A和B)。AIN組的STMN1 mRNA表達水平和陽性表達率均高于對照組(P<0.05;圖1C和D)。

圖1 AIN組和對照組STMN1 mRNA表達水平和陽性表達率的比較A和B為STMN1免疫組化染色(200×);C為STMN1 mRNA表達水平;D為STMN1陽性表達率。a為P<0.05,與對照組比較。

2.2 不同p16、Ki-67表達AIN組織STMN1的比較

AIN組p16和Ki-67陽性表達AIN組織中STMN1 mRNA表達水平和陽性表達率均高于陰性表達組織(P<0.05;表1)。

2.3 不同級別AIN組織STMN1的比較

高級別AIN組織STMN1 mRNA表達水平和陽性表達率高于低級別AIN組織(P<0.05;表2)。

表2 不同級別AIN組織STMN1 mRNA表達水平和陽性表達率的比較

2.4 STMN1表達水平對AIN及分級的ROC曲線分析

STMN1 mRNA表達水平對AIN及高級別AIN均具有診斷價值(P<0.05;圖2和表3)。

表3 STMN1 mRNA表達水平診斷AIN及分級的效能分析

圖2 STMN1 mRNA表達水平診斷AIN及分級的ROC曲線

3 討 論

近些年,肛門癌在全球范圍內的發病率呈增加趨勢,但該疾病的早期癥狀不典型,確診時多已為晚期,生存率低、預后差[7-8]。AIN是肛門癌的癌前病變,高級別AIN具有進展為肛門癌的較高風險,篩查AIN特別是高級別AIN對肛門癌的早發現、早治療具有重要意義。

本研究以STMN1作為分子標志物用于AIN診斷及分級,旨在發現AIN的篩查手段和標志物。微管是構成細胞骨架的成分之一,在維持細胞結構、生長、分裂等生命活動中均發揮重要的作用。STMN1通過調節微管系統的動力學平衡而發揮作用,研究資料顯示,多種癌組織中STMN1表達增加[3-5],STMN1對癌細胞增殖、遷移、侵襲均具有促進作用[9-10]。以上結果提示STMN1具有促癌生物學活性。本研究中,肛門移行區正常黏膜組織的STMN1局限于上皮基底層,AIN的STMN1突破基底層并出現在中間細胞層,提示AIN中存在STMN1的異常表達。

目前關于STMN1陽性表達的評價標準尚不統一,有研究將染色超過上皮厚度1/3評定為陽性,也有研究將染色超出基底層評定為陽性,不同的定性評價標準直接影響評價結果的靈敏度和特異度[11-12]。本研究以染色超出基底層為評定STMN1陽性表達的標準,AIN組織中STMN1的陽性表達率均高于肛門移行區正常黏膜組織,提示STMN1高表達參與AIN的發生。為克服免疫組化染色不同陽性評價標準對評價結果的影響,本研究通過熒光定量PCR對組織中STMN1的表達進行定量分析,結果顯示:AIN組織中STMN1 mRNA表達水平高于肛門移行區正常黏膜組織,STMN1 mRNA表達水平對AIN具有診斷價值。以上研究結果不僅進一步驗證了STMN1高表達參與AIN的發生,還提示局部病灶中STMN1 mRNA表達可作為診斷AIN的分子標志物。

AIN分為1～3級,其中AIN 2級和3級為高級別鱗狀上皮內瘤變,進展為肛門癌的風險高,因此準確診斷高級別AIN具有重要的臨床意義。本研究發現,高級別AIN組織中STMN1 mRNA表達水平和陽性表達率均高于低級別AIN,提示STMN1高表達可能與AIN由低級別上皮內瘤變向高級別上皮內瘤變進展相關。研究資料顯示,p16和Ki-67是反映上皮內瘤變的免疫組化標志物,AIN組織及宮頸上皮內瘤變組織中,p16和Ki-67陽性表達與病變進展、癌變風險增加相關,其機制可能是高表達的p16和Ki-67加速細胞分裂、促進細胞增殖和侵襲[13-15]。本研究分析AIN中STMN1與p16、Ki-67的關系發現,p16和Ki-67陽性的AIN組織中STMN1 mRNA表達高于p16和Ki-67陰性的AIN組織,表明AIN中STMN1 mRNA表達增加與標志物p16、Ki-67陽性表達相關,進而從分子層面揭示STMN1高表達可能促進AIN的進展。最后通過ROC曲線分析證實,STMN1 mRNA表達水平對AIN和高級別AIN具有診斷價值。

綜上所述,STNM1高表達參與AIN的發生發展,對AIN發病及分級具有診斷價值。