雙氫青蒿素對小鼠肺纖維化的影響及作用機制

白君, 陳珠妮, 葉景煥, 熊廣, 李亞清, 謝緯

1.廣州中醫藥大學第四臨床醫學院,廣東深圳 518000;2.深圳市中醫院,廣東深圳 518000

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是局限于肺部的間質性肺炎的一種特殊類型,其組織病理學和胸部影像學表現為普通型間質性肺炎特征的慢性間質性肺疾病,具有慢性、進行性加重及纖維化的特點[1]。近年來青蒿素是中醫藥研究的熱點課題,青蒿素類藥物對自身免疫性疾病(抗炎)、感染性疾病(抗病毒、抗寄生蟲、抗真菌等)、腫瘤及肺間質纖維化等方面均有一定療效[2]。有研究發現,肺纖方能夠減輕小鼠肺纖維化及肺泡炎癥程度,抑制NIH3T3成纖維細胞增殖[3],本研究在此基礎上探討單藥雙氫青蒿素抗肺纖維化的作用及可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與細胞

35只SPF級雄性昆明小鼠購買于南方醫科大學實驗動物中心;NIH3T3成纖維細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 主要儀器與試劑

鹽酸博萊霉素針劑(上海生工);復方雙氫青蒿素片(重慶通和藥業有限公司);甲潑尼龍(比利時輝瑞制造公司);水合氯醛、羥脯氨酸測定試劑盒和ELISA檢測試劑盒(南京建成A030);MTS細胞增殖試劑盒(Promega公司);兔抗小鼠MMP-2(ab97779)、TIMP1(ab38978)、Cyclin D1(ab16663)多克隆抗體(Abcam公司)。

1.3 模型制作[4]及分組

將35只雄性昆明小鼠采用隨機數字法分成空白對照組、模型組、甲潑尼龍組、雙氫青蒿素低劑量組、雙氫青蒿素高劑量組,每組各7只小鼠。將模型組、甲潑尼龍組、雙氫青蒿素低劑量組、雙氫青蒿素高劑量組小鼠用4%水合氯醛(0.01 mL/g)150 μL腹腔注射麻醉后,固定小鼠,沿著聲門將霧化器(針頭灌胃器)插入氣管并噴入博來霉素溶液(8 mg/kg),隨后將小鼠起立旋轉3～5 min,盡量使噴入的博來霉素溶液在兩肺內均勻分布,間隔10天后第2次給同等劑量博來霉素,第2次給藥后14天完成模型構建[4]?？瞻讓φ战M使用生理鹽水,以上各組24天后成模。成模后第2天開始給藥治療,甲潑尼龍組、雙氫青蒿素低劑量組、雙氫青蒿素高劑量組,每日分別給與甲潑尼龍1 mg/kg,雙氫青蒿素20、50 mg/kg灌胃,空白對照組、模型組則給與等量生理鹽水;各組治療14天后處死,留取肺臟標本進行相關指標檢測。

1.4 小鼠肺組織病理學檢查和肺泡炎癥、肺纖維化評分

小鼠被處死后取左肺組織,固定后進行脫水,石蠟包埋和切片,HE染色及Masson染色,觀察小鼠肺組織病理學情況,應盡量避開大氣管和大血管進行拍照。根據肺泡炎癥評價方法[5]分為0～3級,一級為輕度改變,病變范圍占全肺比例<20%計1分;二級為中度改變,病變范圍占全肺比例20%～50%計2分;三級為重度改變,病變范圍占全肺比例50%計3分;0級是無明顯病理改變,肺泡結構正常,計0分。將肺組織纖維化程度分為8級[6],一級計1分,可見局部輕纖維及肺泡輕微腫脹;二級計2分,可見明顯纖維化出現;三級計3分,出現連續纖維區域;四級計4分,纖維面積≤10%;五級計5分,纖維面積占10%～50%;六級計6分,纖維面積>50%;七級計7分,可見肺泡腔充滿纖維組織,肺大皰出現;八級計8分,整個區域出現纖維化病灶;正常肺組織為0級。隨機選取每組所有小鼠各10個視野,將肺泡炎癥評分和纖維化評分分值的均數作為該小鼠樣本肺泡炎癥、纖維化分級評分。采用盲評方法。

1.5 羥脯氨酸測定

取小鼠右肺組織,沖洗、濾紙吸濕后稱取0.3 g肺組織,研磨后將其制成肺組織勻漿,離心后提取上清液,測定羥脯氨酸含量。羥脯氨酸含量測定的步驟按照ELISA試劑盒說明書規范操作。

1.6 小鼠NIH3T3成纖維細胞培養

培養NIH3T3成纖維細胞,待細胞長到90%匯合時胰酶消化,于6孔板中種植對數生長期的細胞,待細胞貼壁后行藥物干預。共分6組,分別為對照組(Ctrl組)、雙氫青蒿素低劑量組(LQ組)、雙氫青蒿素中劑量組(MQ組)、雙氫青蒿素高劑量組(HQ組)、甲潑尼龍低劑量組(LM組)、甲潑尼龍高劑量組(HM組);LQ、MQ、HQ組分別給與5、10、20 mg/L雙氫青蒿素干預,LM、HM組分別給與10、20 mg/L甲潑尼龍干預;Ctrl組則給與等體積磷酸鹽緩沖鹽溶液。

1.7 MTS法檢測細胞增殖

待細胞長到90%匯合時胰酶消化取對數生長期的細胞種于6孔板中,0.5×104個/孔。待細胞貼壁后,吸出部分等量培養基,分別換為含有等量各劑量的雙氫青蒿素和甲潑尼龍。分別在0、4、24、48、72 h加入MTS檢測溶液10 μL,37 ℃下孵育,最后于490 nm波長下,用酶標儀檢測光密度值(optical density,OD)。細胞存活率(%)=(加藥細胞OD/對照細胞OD)×100%。

1.8 Western blotting法測定成纖維細胞相關蛋白的表達

于6孔板中培養對數生長期的NIH3T3細胞系,經各劑量雙氫青蒿素及甲潑尼龍干預24 h后,提取細胞總蛋白,完成電泳,濾膜、封閉后,加入CyclinD1、MMP-2、TIMP1抗體,孵育后加入相對應的HRP標記的二抗,化學發光底物顯色后,使用Bio-Rad取像,最后蛋白條帶光密度分析在Scion Image軟件進行。

1.9 統計學方法

采用SPSS 25.0版統計軟件,符合正態分布、方差齊性的計量資料采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HE染色及肺泡炎癥評分

HE染色結果顯示,空白對照組肺組織結構清晰,肺泡無明顯萎縮或擴張,肺泡壁無增厚,肺間質無炎癥細胞浸潤;模型組肺泡間隔被大量破壞,肺泡結構紊亂,實質區明顯增多,有大量炎癥細胞浸潤;甲潑尼龍組、雙氫青蒿素低劑量組、雙氫青蒿素高劑量組肺泡結構基本完整,較少見肺泡塌陷或實變,相比模型組肺間隔僅輕度增寬,肺泡內炎癥細胞浸潤較少,肺泡破壞程度有所下降(圖1)。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色結果(400×)

與空白對照組比較,模型組小鼠肺泡炎癥評分升高(P<0.05);與模型組比較,甲潑尼龍組、雙氫青蒿素低劑量組、雙氫青蒿素高劑量組小鼠肺泡炎癥評分降低(P<0.05);與甲潑尼龍組比較,雙氫青蒿素低劑量組肺泡炎癥評分升高(P<0.05);雙氫青蒿素低劑量組較雙氫青蒿素高劑量組升高(P<0.05;圖1和表1)。

表1 各組小鼠肺組織肺泡炎癥評分及肺纖維化評分比較(n=7) 分

2.2 Masson染色及肺纖維化評分

空白對照組肺組織肺泡結構整齊、規則,除支氣管及血管壁有較少淡藍色絲狀纖維沉積,肺泡間隔無明顯膠原纖維增生;模型組可見肺組織結構紊亂,肺泡間隔廣泛增厚明顯(間隔厚度≥3倍對照組),大量藍色膠原沉積于肺泡間隔及肺間質;較模型組,甲潑尼龍組,雙氫青蒿素低劑量組、雙氫青蒿素高劑量組小鼠肺組織藍色膠原沉積均明顯減輕(圖2)。與空白對照組比較,模型組肺纖維化評分升高(P<0.05);與模型組比較,甲潑尼龍組、雙氫青蒿素低劑量組、雙氫青蒿素高劑量組小鼠肺組織纖維化評分降低(P<0.05;表1)。

圖2 各組小鼠肺組織形態masson染色結果(400×)

2.3 各組肺組織羥脯氨酸含量比較

與空白對照組比較,模型組羥脯氨酸含量升高(P<0.05);與模型組比較,甲潑尼龍組、雙氫青蒿素低劑量組、雙氫青蒿素高劑量組羥脯氨酸含量下降(P<0.05;表2)。

表2 各組小鼠肺組織羥脯氨酸含量比較 mg/g

2.4 各組細胞增殖的比較

藥物干預4 h時,與Ctrl組相比,HM、LQ、MQ、HQ組細胞增殖率下降(P<0.05);干預24 h及以上,與Ctrl組相比,LM、HM、LQ、MQ、HQ組均能明顯抑制細胞增殖,且隨著時間延長,青蒿素各劑量組組間增殖率下降(P<0.05;表3)。

表3 MTS檢測不同藥物對小鼠成纖維細胞NIH3T3細胞增殖影響

2.5 成纖維細胞相關蛋白的表達水平

與Ctrl組相比,LQ、MQ、HQ、LM、HM組CyclinD1和MMP-2蛋白的表達均有下調,且隨著雙氫青蒿素劑量的增加,CyclinD1和MMP-2蛋白水平也下降;HM組與HQ組CyclinD1和MMP-2蛋白下降效果大致相當。與Ctrl組相比,LQ、MQ、HQ、LM、HM組對TIMP1蛋白的表達均有上調作用,以HQ、HM組上調最明顯,兩者上調作用大致相同(圖3和表4)。

表4 蛋白質印跡法測定細胞MMP-2、TIMP1、Cyclin D1蛋白條帶灰度值

圖3 Western blotting測定MMP-2、TIMP1、Cyclin D1蛋白表達

3 討 論

青蒿是中藥的一種,具有清虛熱、涼血除蒸、解暑截瘧的功效。青蒿素是從菊科植物黃花蒿(artemisia annua L)中提取的化合物,而雙氫青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是體內青蒿素的活性代謝產物。雙氫青蒿素可通過抑制氧化應激反應、降低細胞炎癥因子表達等方式,減輕肺組織炎癥、降低膠原合成水平、抑制血管內皮細胞分化、調節免疫狀態等,并以此來抑制肺纖維化進程[7-8]。

本研究應用不同劑量的DHA、甲潑尼龍對體外培養的小鼠胚胎成纖維細胞(NIH3T3細胞)進行干預,MTS檢測法提示DHA能抑制NIH3T3細胞的增殖能力,在一定范圍內呈時間及劑量依賴。且小鼠胚胎成纖維細胞經DHA干擾后,炎癥及肺纖維化評分、羥脯氨酸含量均下降,說明DHA能很好地減少肺損傷,抗炎、抑制成纖維細胞增殖,從而減輕肺纖維化程度。但目前肺纖維化的發病機制尚不明確,大部分學者認為IPF的發生[9]可能與肺泡上皮細胞受損、肌成纖維細胞異常增殖活化和細胞外基質過度積聚有關。研究指出,肺纖維化的形成過程與MMPs/TIMPs系統平衡和Rho/Rock信號通路參與調節成纖維細胞增殖有關[10-11]。如Rho激酶抑制劑法舒地爾[12]可逆轉MMPs/TIMPs比值,且抑制成纖維細胞CyclinD1蛋白表達,進而抑制成纖維細胞增殖,而前期課題的中藥復方肺纖方也具有同樣的作用[3]。

基質金屬蛋白酶組織抑制因子是其特異性的組織抑制因子,可以特異性抑制幾乎所有基質金屬蛋白酶,對維持ECM蛋白形成和平衡具有重要意義[13]。研究發現,MMP-2在IPF病人肺組織中廣泛表達[14],MMP-2和MMP-9的過度表達被認為在基底膜破壞中起關鍵作用[15]。因為肺泡壁的結構完整性依賴于基底膜,因此上皮下基底膜的破壞可能是肺泡纖維化過程中的早期事件,這于IPF的發生來說至關重要。

研究發現,被激活的Rho/ROCK信號通路能影響細胞骨架重組調節,介導細胞遷移,參與肺、肝、腎臟等臟器的纖維化過程,還能介導炎癥反應和氧化應激、促使成纖維細胞上皮-間質轉化、分泌膠原蛋白等,參與肺纖維化的發生、發展[16-19]。G1/S期以及有絲分裂過程中ROCK被活化,抑制ROCK活力會促進G1期中心粒的異常分離[20]。在細胞增殖周期中,G1/S期和G2/M期是兩個關鍵性限制點,G1期中兩個關鍵調節蛋白分別是CyclinD1和CyclinE蛋白。CyclinD蛋白在細胞增殖中起正性調節作用,CyclniD1表達增加促使S期向G1期轉換,推動細胞的有絲分裂。本實驗發現DHA可以使CyclinD1蛋白表達下降,說明DHA可抑制成纖維細胞增殖?？梢?DHA對于IPF中成纖維細胞病態增殖的治療有一定價值。

綜上,DHA對降低肺纖維化小鼠肺泡炎癥、肺纖維化程度及羥肺氨酸水平的治療有一定作用,表明雙氫青蒿素可能是治療肺纖維化的潛在良好候選藥。