基于生物信息學篩選膿毒癥中性粒細胞活化的關鍵基因

陸洲成, 鐘樹武, 言彩紅, 張群峰

南華大學衡陽醫學院附屬第二醫院重癥醫學科,湖南衡陽 421001

膿毒癥為宿主對感染的免疫反應失調引起的危及生命的器官功能障礙,是引起重癥監護病房(intensive care unit,ICU)患者死亡的主要原因之一[1-2]。目前,膿毒癥的治療手段主要是抗感染和對癥支持治療,但其特異性療法仍缺乏[3]。中性粒細胞是一種重要的免疫細胞,位于病原微生物入侵的第一線,對感染的控制起著重要作用[4]。在膿毒癥發病的過程中,中性粒細胞積極響應并發揮著抗感染作用,然而,失調和過度活化的中性粒細胞也引起劇烈的炎癥反應和嚴重的組織損傷,導致膿毒癥患者預后不良[5]。因此,對中性粒細胞活化的調控是治療膿毒癥的重要方面[6],中性粒細胞活化的關鍵基因有望成為診斷和治療膿毒癥的生物標志物。本研究通過生物信息學方法,篩選出膿毒癥中性粒細胞活化的關鍵基因,以期為未來膿毒癥的早期診斷、預后判斷及治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 數據獲取與整理

從GEO數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載4個成人膿毒癥芯片數據集(GSE69528、GSE28750、GSE57065、GSE95233)及1個兒童膿毒癥芯片數據集GSE66099。GSE69528包含83例膿毒癥和55例對照樣本;GSE28750包含10例膿毒癥樣本和20例對照樣本;GSE57065包含82例膿毒癥樣本和25例對照樣本;GSE95233包含102例膿毒癥樣本和22例對照樣本。GSE66099包含199例膿毒癥樣本和47例對照樣本。所有數據集所取樣本為全血樣本。

1.2 差異表達基因篩選

采用Perl語言(perl軟件v5.32.0版本)合并數據集,采用R語言(R軟件3.6.3版本)進行標準化及表達值計算等處理。差異表達基因(differentially expressed gene,DEG)分析使用R語言,采用Fold-change和T-test進行DEG篩選,篩選條件為|logFc|≥1、P<0.05,結果用火山圖顯示。

1.3 重疊DEG鑒定

采用韋恩圖(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)識別重疊的DEG。

1.4 DEG富集分析

對4個成人數據集重疊DEG進行基因本體論(gene ontology,GO)功能分析,包括生物過程(biological process,BP)、細胞成分(cell composition,CC)和分子功能(molecular function,MF)。

1.5 蛋白互作網絡構建

重疊的DEG在STRING數據庫網站(https://cn.string-db.org/)中進行多個蛋白質搜索,以預測蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網絡,運用Cytoscape軟件(https://cytoscape.org/)將PPI網絡結果可視化并進行模塊分析,使用Ctyohubba插件MCC算法提取PPI網絡中樞紐基因即為關鍵基因。

1.6 關鍵基因診斷價值的鑒定

通過ROC曲線下面積(area under the curve,AUC)確定關鍵基因對膿毒癥的診斷價值。

1.7 免疫浸潤分析

采用CIBERSORT算法評估22個免疫細胞比例,分析各數據集膿毒癥組與對照組之間的免疫細胞分布。Wilcoxon秩和檢驗比較免疫細胞在兩組中的表達差異。P<0.05為差異具有統計學意義。

1.8 外部數據集驗證

通過兒童膿毒癥芯片數據集GSE66099 199例膿毒癥和47例對照組全血樣本進行關鍵基因表達的驗證,以同樣的生物信息分析方法進行分析。

2 結 果

2.1 膿毒癥重疊DEG篩選及GO富集分析

GSE69528、GSE95233、GSE57065、GSE28750數據集分別篩選出1 328、986、789、824個DEG,得到重疊DEG 299個(圖1A),其中上調112個,下調187個。重疊DEG的PPI可視化見圖1B。GO富集結果顯示,BP主要富集于中性粒細胞活化、中性粒細胞脫顆粒等;MF主要富集于肽酶調節活性、糖胺聚糖結合等;CC主要富集于特殊顆粒、囊泡腔等(圖1C)。

圖1 膿毒癥的重疊DEG篩選及GO富集分析結果A為DEG韋恩圖;B為DEG的PPI網絡圖(藍色為下調基因、紅色為上調基因);C為DEG的GO富集分析氣泡圖。

2.2 膿毒癥中性粒細胞活化的關鍵基因

與中性粒細胞活化相關的DEG共55個(圖2A)。55個候選DEG中的49個DEG被篩選進入到DEG PPI網絡復合體中,PPI可視化見圖2B;進一步篩選出前10位樞紐基因作為膿毒癥中性粒細胞活化相關的關鍵基因,分別為MPO、CTSG、ELANE、MMP9、LCN2、MMP8、LTF、CAMP、S100A12、DEFA4。

2.3 中性粒細胞活化的關鍵基因的表達水平及診斷價值

10個關鍵基因在4個成人數據集的膿毒癥樣本組中均上調(P<0.05);ROC AUC均大于0.7(圖3),提示具有較好的診斷價值。

2.4 膿毒癥數據集免疫細胞的差異分析

成人膿毒癥患者全血樣本中單核細胞、中性粒細胞、M0巨噬細胞均上調,其中以中性粒細胞上調最為顯著(圖4;P<0.05)。

圖4 4個成人數據集膿毒癥患者與對照組全血樣本免疫細胞的差異分析a為P<0.05,與對照組比較。

2.5 關鍵基因的驗證

采用兒童膿毒癥芯片數據集GSE66099進行驗證,篩選到1 143個DEG,其中上調562個,下調581個(圖5A)。GO富集分析的BP、CC、MF結果驗證了成人膿毒癥數據集的富集結果(圖5B)。篩選出與中性粒細胞活化相關的125個DEG(圖5C)和10個關鍵基因(圖5D),其中8個與成人膿毒癥數據集中篩選出的關鍵基因相同。成人的10個關鍵基因在兒童膿毒癥全血樣本表達上調(P<0.05;圖5E),ROC AUC均大于0.7,驗證關鍵基因對兒童膿毒癥亦有較好的診斷價值(圖5E)。兒童膿毒癥數據集免疫細胞的差異分析提示中性粒細胞上調最為顯著(圖5F;P<0.05),與成人膿毒癥數據集中的趨勢一致。

3 討 論

膿毒癥早期階段,局部感染未得以有效控制,導致固有免疫細胞的過度活化,最終爆發細胞因子風暴;在后期,因早期免疫細胞的過度活化,大量免疫細胞損傷或死亡,使免疫抑制持續、免疫功能低下,最終導致繼發嚴重感染或膿毒癥的復發[7]。在膿毒癥中,中性粒細胞參與抗感染、炎癥誘導、組織病理損傷,合并出現功能障礙和遷移功能異常[8]。本文GO分析結果證實中性粒細胞活化是膿毒癥發生發展中的關鍵環節,也顯示了其可能的相關通路以及生物學過程,主要包括中性粒細胞激活、中性粒細胞脫顆粒、參與免疫反應的中性粒細胞活化、中性粒細胞介導的免疫;提示中性粒細胞活化是膿毒癥發生發展的重要分子生物學過程。鑒定篩選膿毒癥中性粒細胞活化關鍵基因,將為膿毒癥的早期診斷、治療干預的靶點選擇提供新線索。

本研究篩選出膿毒癥中性粒細胞活化相關的前10位樞紐基因為關鍵基因,分別為S100A12、CTSG、MPO、MMP9、MMP8、LCN2、ELANE、LTF、CAMP、DEFA4。S100A12、CTSG被報道由中性粒細胞分泌[9-10]。S100A12是S100亞家族中的一種蛋白,該蛋白被認為參與特定的鈣依賴性信號轉導途徑,在感染性疾病中發揮重要的生物學作用。S100A12在新生兒敗血癥中顯著升高,可被視為其新的生物標志物。在膿毒癥誘導的急性呼吸窘迫綜合征(aute respiratory distress syndrome,ARDS)中,S100A12可通過激活NLRP3胞質體信號促進膿毒癥誘導的ARDS中的炎癥和細胞凋亡,S100A12可能是膿毒癥誘發的ARDS臨床診斷中肺損傷的有關生物標志物[11]。CTSG可修飾趨化因子、細胞因子和細胞表面受體而在炎癥和免疫反應中發揮重要作用,還能消滅中性粒細胞內外病原體[12],GTSG在膿毒癥中暫未有研究報道,但有著潛在的研究價值。MPO是中性粒細胞激活的標志,在炎癥反應的調節中發揮關鍵作用[13]。在T?rnblom等[14]的一項研究中發現中性粒細胞活化標志物MPO,MPO的升高是膿毒癥演變的早期事件,持續時間超過促炎細胞因子白細胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8反應消退的時間,不易受到采樣時間影響,未來可能作為早期膿毒癥診斷的可靠指標。Bonaventura等[15]研究結果表明MPO升高可提示中性粒細胞的早期過度激活并提示預后不良。ELANE是絲氨酸蛋白酶的一個亞家族,水解專門的中性粒細胞溶酶體中的蛋白質、嗜藍粒細胞顆粒以及細胞外基質。研究報道人類嗜中性粒細胞釋放ELANE選擇性殺死多種癌細胞[16]。研究發現,ELANE相關的中性粒細胞減少與感染密切相關[17]。在Gu等[18]的研究中,發現在體外miR-608結合ELANE mRNA編碼區的靶位點,并抑制其在人單核細胞中的表達,可能是診斷或治療膿毒癥的新靶點。MMP9可以保護中性粒細胞彈性蛋白酶活性,還能從IL-8上分解一個62氨基酸肽,使其向中性粒細胞的趨化活性增加10倍,這種酶可能通過IV型膠原和彈性蛋白的蛋白水解在退行性和炎癥性疾病中發揮作用[19]。研究顯示MMP9在膿毒癥患者中上調[20-21],提示MMP9未來可能作為膿毒癥的一個潛在治療靶點。MMP8也被報道在膿毒癥中上調,與其預后不良和介導白細胞黏附相關[22]。LTF存在于中性粒細胞的特定顆粒中,LTF水平升高可能是中性粒細胞活化的標志。在Anderson等[23]的研究中,與其他病理相比,膿毒癥組中LTF的水平升高。LCN2可作為膿毒癥相關的ARDS、腎損傷及腦功能障礙的生物標志物[24-25]。在LPS誘導的敗血癥模型中,LCN2敲除小鼠表現出鐵代謝失調,白細胞凋亡,促炎細胞因子釋放和死亡率增加[26]。DEFA4是由DEFA4基因編碼的人類防御素肽,在中性粒細胞顆粒中表達,可保護宿主免受細菌和病毒的侵害[27]。以上研究結果支持了本次生物信息學的篩選結果。

綜上所述,本研究篩選出膿毒癥中性粒細胞活化相關的關鍵基因10個,并進行了驗證。10個關鍵基因可能參與中性粒細胞活化的多個信號途徑,從而在膿毒癥的發病過程中起重要作用;為未來膿毒癥的早期診斷、預后判斷及治療提供新思路。