栝樓桂枝湯調節小膠質細胞活化后的表型轉化緩解腦缺血再灌注大鼠模型的神經損傷

鐘興華，楊勁博，胡海霞

（福建中醫藥大學科技創新與轉化中心，福建 福州 350122）

缺血性腦卒中常伴隨著嚴重的并發癥，有較高的致殘率，給社會、家庭帶來沉重負擔［1-2］。腦卒中后腦損傷是由多種細胞相互作用引起的級聯反應，腦卒中后過度的神經炎癥反應是導致神經元功能異常的主要因素之一［3］。研究表明缺血性腦損傷后的炎癥反應會使小膠質細胞活化，活化后的小膠質細胞會轉化為M1 型（促炎型）及M2 型（抗炎型）2 種表型，M1 型小膠質細胞會釋放過量的促炎因子，導致炎癥反應持續進展，使突觸結構異常和突觸減少［4-6］，進而導致神經元的損傷［7］。相比之下，M2 型小膠質細胞會增強吞噬活性以清除碎片，并產生許多抗炎和修復因子。因此調節小膠質細胞活化后的表型轉化，抑制卒中后過度的炎癥反應，可改善神經損傷，為缺血性腦卒中治療提供了重要的研究方向。

栝樓桂枝湯來源于《金匱要略》，治療外感熱病引起的肢體痙攣，也可用于緩解卒中后肢體痙攣［8］。研究證實：栝樓桂枝湯可緩解缺血再灌注損傷模型大鼠卒中后痙攣狀態，抑制神經細胞的凋亡，且可明顯降低腦內小膠質細胞的活化及炎癥因子、趨化因子的表達［9］，但其具體機制尚不明確。本研究通過建立腦缺血再灌注大鼠模型，調控小膠質細胞活化后的炎癥反應，進一步明確栝樓桂枝湯對腦保護的分子作用機制，為栝樓桂枝湯治療缺血性腦卒中提供科學依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF 級健康雄性SD 大鼠30 只，8～12 周齡，體質量（240±20）g，購自上海斯萊克實驗動物責任有限公司，實驗動物生產許可證號：SYXK（閩）2019-0007，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2019-0007。將小鼠置于籠具中飼養，室溫22～24 ℃，相對濕度50%～60%。本研究已通過福建中醫藥大學動物倫理委員會審核（FJTCM IACUC 2020086）。

1.2 實驗藥物 栝樓桂枝湯由栝樓根30 g，桂枝9 g，生姜9 g，白芍9 g，大棗9 g，甘草6 g 組成，購自福建中醫藥大學附屬第三人民醫院。栝樓桂枝湯水提液制備：加5 倍量水，浸泡30 min，加熱回流2 次，每次1 h，濾液合并濃縮至1.06 g/mL。

1.3 實驗試劑 大鼠白細胞介素-1（IL-1）ELISA試劑盒（合肥萊爾生物科技有限公司，貨號：LEB1145）；精氨酸酶1（Arg-1）抗體（武漢三鷹生物科技有限公司，貨號：66129-1）；組織相容性復合物-Ⅱ（MHC-Ⅱ，貨號：ab92511）、離子鈣接頭蛋白（Iba-1，貨號：ab178846）、微管相關蛋白2（MAP-2，貨號：ab5392）抗體均購自英國Abcam 公司；DAB 顯色試劑盒（貨號：DA1015）、中性樹膠（貨號：G8590-100ML）、檸檬酸鈉緩沖液（貨號：C1010-2L）均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 實驗儀器 7500 熒光定量PCR 儀（美國ABI公司）；石蠟包埋機（臨沂愛華生物科技有限公司，型號：BMJ-1B）。

2 方 法

2.1 分組與造模 將SD 大鼠隨機分為假手術組10 只和造模組20 只。造模組采用改良型線栓法［10］使大鼠左側大腦中動脈發生梗死，1.5 h 后再灌注建立腦缺血再灌注模型；假手術組僅鈍性分離頸部肌肉血管，不插入線栓。采用Longa 評分［11］進行神經功能損傷程度的評價，1～3 分視為造模成功。采用抽簽法將造模成功的大鼠分成模型組和栝樓桂枝湯組各10 只。

2.2 干預 于造模成功后第2 天開始灌胃干預，栝樓桂枝湯組按0.15 mg/（kg·d）給予栝樓桂枝湯藥液灌胃，假手術組和模型組按10 mL/（kg·d）給予生理鹽水灌胃，每日1次，持續灌胃1 周。

2.3 神經行為學評分 采用Longa 評分［11］對干預前后神經功能缺損狀態進行評估。① 大鼠可自主活動，沒有神經功能異常狀態，計為0 分；② 提尾時，前肢不能完全屈伸，計為1 分；③ 自主行動時，大鼠向大腦缺血側病灶對側轉圈，計為2 分；④ 自主行動時，大鼠身體向大腦缺血側病灶對側歪斜，計為3 分；⑤ 大鼠不能自主行走，有意識昏迷，計為4 分。評分越高則說明大鼠神經功能缺損越嚴重。

2.4 取材 2%的戊巴比妥鈉動物麻醉后，腹主動脈取血，靜置30 min 后，12 000 r/min 離心30 min，取血清于-20 ℃凍存，用于后續ELISA 實驗。同時各組選取部分大鼠腦組織于-20 ℃凍存，用于Western blot 實驗。剩余大鼠從左心室灌注生理鹽水約100 mL，然后抽取50 mL 4%多聚甲醛繼續灌注，固定腦組織，隨后斷頭取腦，進行脫水、石蠟包埋以及切片，用于HE 染色及免疫組化實驗。

2.5 ELISA 法檢測大鼠血清IL-1 含量 取外周血血清，每組單次設3 個復孔，獨立重復實驗3 次以上，按ELISA 試劑盒說明書進行操作，繪制標準曲線，檢測并計算IL-1 含量。

2.6 HE 染色觀察大鼠腦組織病理形態 石蠟切片置于梯度酒精脫蠟，隨后分別用蘇木素與伊紅染色細胞核與細胞質，PBS 溶液清洗，中性樹脂封片。光學顯微鏡下觀察大鼠大腦腦組織細胞形態并拍照。

2.7 Western blot 檢測大鼠腦組織MHC-Ⅱ、Arg-1蛋白表達量 取各組腦組織使用蛋白裂解液提取總蛋白，BCA 法測定濃度。經電泳、轉膜，快速封閉液封閉15 min，分別加入MHC-Ⅱ（1∶1 000）、Arg-1（1∶8 000）、vinculin（1∶1 000）抗體，4 ℃孵育過夜，TBST 溶液洗膜后，再加兔二抗（1∶5 000）及鼠二抗（1∶3 000），37 ℃下孵育1 h，TBST 溶液洗膜3 次后加ECL 化學發光劑顯影。應用Image Lab 圖像分析軟件測定目的條帶灰度值，計算目的蛋白表達量。

2.8 免疫組化觀察大鼠腦組織Iba-1、MAP-2 蛋白表達水平 取大鼠腦組織，制備蠟塊，并包埋切片備用。將石蠟切片放入檸檬酸鹽緩沖溶液中，水浴加熱10 min，冷卻至室溫后，PBS 溶液清洗3 次。切片上滴加封閉液，室溫下封閉20 min。在切片上滴加Iba-1 及MAP-2 一抗，4 ℃孵育過夜，PBS 溶液清洗3次。在切片上滴加二抗，37 ℃下孵育抗體20 min，PBS 溶液清洗3 次。在切片上滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），37 ℃孵育20 min。隨后在切片上滴加DAB 顯色試劑，顯微鏡觀察并拍照后，若出現棕色或棕褐色表示Iba-1、MAP-2 陽性。應用ImageJ 軟件計數400 倍鏡下隨機5 個視野的陽性細胞數，取平均值，求得陽性細胞數目。

2.9 統計學方法 采用SPSS 23.0 軟件進行數據處理。計量資料符合正態分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊性采用LSD-t檢驗，方差不齊采用Games-Howell 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 3 組干預前后Longa 評分比較 見表1。

表1 3 組干預前后Longa 評分比較（±s） 分

表1 3 組干預前后Longa 評分比較（±s） 分

注：與假手術組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

干預后0.0±0.0 1.82±0.501）1.05±0.222）組別假手術組模型組栝樓桂枝湯組n333干預前0.0±0.0 2.09±0.591）2.13±0.551）

3.2 3 組血清IL-1 含量比較 見圖1。

圖1 3 組血清IL-1 含量比較

3.3 3 組腦組織病理形態變化 假手術組大鼠腦組織結構清晰完整，神經細胞均勻分布，無異常；模型組大鼠腦組織結構排列紊亂，神經元被破壞，出現細胞皺縮、細胞核深染現象，同時大量炎性細胞貫穿腦組織；與模型組比較，栝樓桂枝湯組腦組織結構均趨于正常，神經細胞壞死顯著減少。見圖2。

圖2 3 組腦組織HE 染色圖（×400）

3.4 3組腦組織MHC-Ⅱ、Arg-1蛋白表達量比較 見圖3。

圖3 3 組腦組織MHC-Ⅱ、Arg-1 蛋白表達量比較

3.5 3 組腦組織Iba-1、MAP-2 蛋白表達水平比較 假手術組Iba-1 陽性表達較少，顏色較淺，MAP-2 陽性表達較多，顏色較深。與假手術組比較，模型組Iba-1 陽性表達明顯增多（P＜0.05），顏色為棕褐色；MAP-2 蛋白表達明顯減少（P＜0.05），并且神經元細胞變小，排列不規則，棕黃色染色顆粒較少。與模型組比較，栝樓桂枝湯組Iba-1 陽性表達明顯降低（P＜0.05），MAP-2 陽性表達明顯提高（P＜0.05）。見圖4、圖5。

圖4 3 組腦組織Iba-1、MAP-2 免疫組化圖（×400）

圖5 3 組腦組織Iba-1、MAP-2 蛋白表達水平比較

4 討 論

越來越多的證據表明缺血后產生的炎癥反應是致病過程的重要促成因素［12］，缺血性卒中早期產生的炎癥反應會促進腦梗死的發展，致使缺血半影區發生不可逆的損傷，加劇缺血再灌注損傷［13］。小膠質細胞是大腦的免疫調節器，在正常條件下不斷監測大腦微環境［14-15］，它的活化在神經炎癥的進展中尤為重要［16］。腦缺血后引起的炎癥反應會引起小膠質細胞表型的轉化，即M1 型（促炎型）或M2型（修復型）2 種表型，小膠質細胞活化后的M1 表型會產生損傷神經的細胞因子，進而加重神經炎癥，引起神經元細胞的損傷［17-18］，而M2 表型則會產生相應的神經保護介質。腦卒中后壞死神經細胞的清除以及腦梗死后神經功能的恢復需要小膠質細胞的活化［19］。

腦卒中后肢體痙攣歸屬于中醫學“痙病”范疇，病機為氣血陰陽失衡，筋脈失于濡養，因此治則當以調和氣血陰陽、滋養筋脈為主。栝樓桂枝湯中天花粉清熱潤燥、濡潤筋脈；桂枝、白芍互用，酸甘化陰，具有通緩脈絡之效；大棗、生姜可資助脾胃之氣，促進周身氣血運化；甘草調和諸藥之性。諸藥互通互用，具有柔潤筋脈、解肌止痙的功效。臨床研究發現栝樓桂枝湯可改善中風后肢體痙攣患者的肢體運動功能及生活活動能力［1］。相關基礎研究也提示栝樓桂枝湯可以調控HIF-1α 信號通路，進而促進腦卒中后腦血管的再生，進而緩解神經細胞損傷、改善腦缺血再灌注大鼠神經功能缺損狀態［20］。本課題組前期研究也表明栝樓桂枝湯可改善腦缺血再灌注大鼠的運動功能障礙，可降低患側腦組織的炎癥反應水平，抑制神經元的凋亡，保護缺血半暗帶［21-23］。

Iba-1 也稱為同種異體移植炎癥因子，是細胞骨架結合蛋白，參與活化小膠質細胞/巨噬細胞狀態相關的形態變化，是小膠質細胞的特異性標志物，可以反映小膠質細胞的活化［24］。MAP-2 是神經元特異性的細胞骨架蛋白，主要表達在軸突，能夠作為神經細胞的表型標記物，與中樞神經系統內神經元的形態、生長及功能密切相關，可以充分反應神經細胞的損傷［25］。本研究結果顯示：與假手術組比較，模型組Logna 評分明顯升高，血清IL-1含量明顯提高，病理形態顯示腦組織神經元結構破壞及炎性細胞浸潤情況明顯，大鼠腦組織Iba-1 蛋白表達水平明顯提高，MAP-2 蛋白表達水平明顯降低，提示腦缺血再灌注模型大鼠炎癥反應明顯。栝樓桂枝湯干預結束后，腦缺血再灌注大鼠Logna評分明顯降低，外周血IL-1 含量明顯減少，缺血側腦組織炎癥浸潤、神經元損傷程度明顯改善，Iba-1蛋白表達水平明顯降低，MAP-2 蛋白表達水平明顯提高，提示栝樓桂枝湯能減輕腦卒中后的炎癥反應，改善腦缺血再灌注大鼠卒中后的神經功能缺損。

MHC-Ⅱ主要位于抗原提呈細胞上，能夠將細胞外來抗原利用MHC-Ⅱ提呈給輔助細胞，激活免疫細胞，從而引起機體的炎癥反應，是M1 型小膠質細胞的常用標記物［26］。Arg-1 為M2 型小膠質細胞最佳標記物之一，可以通過促進病原體的識別、結合和內溶質作用來介導抗炎反應，主要受信號轉導和轉錄活化因子6（STAT6）調控，因此是重要的抗炎因子，可抑制炎癥反應并促進機體修復［27］。本研究結果顯示：與假手術組比較，模型組MHC-Ⅱ蛋白表達量明顯升高，Arg-1 蛋白表達量明顯降低，提示腦缺血再灌注大鼠腦組織中M1 型小膠質細胞的表達增多，M2 型小膠質細胞的表達減少。與模型組比較，栝樓桂枝湯組MHC-Ⅱ蛋白表達量明顯降低，Arg-1 蛋白表達量明顯升高，提示栝樓桂枝湯可以促進腦缺血再灌注大鼠腦組織中M2 型小膠質細胞的表達，抑制M1 表型的表達。

綜上所述，栝樓桂枝湯可能通過調控小膠質細胞活化后的表型，即上調M2 表型，下調M1 表型，從而抑制炎癥反應，改善腦缺血再灌注大鼠的神經細胞損傷。但是，炎癥反應涉及多種調控通路，級聯反應復雜，栝樓桂枝湯通過調控小膠質細胞活化減弱缺血性腦卒中后炎性反應，其機制是否涉及相應調控通路，還需要進一步研究。