一枝黃花含漱液質量標準研究

曾茂貴，張 寬，謝晶心，鄭文煒，黃飛翔

（1.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建 福州 350003；2.福建省醫療機構中藥制劑重點實驗室，福建 福州 350003）

一枝黃花為菊科植物一枝黃花Solidago decurrensLour. 的干燥全草［1］，性辛苦涼，歸肺、肝經，其本草考證最早始載于《植物名實圖考》［2］，具有清熱解毒、疏散風熱的功效。一枝黃花提取物具有殺菌、消炎、抗腫瘤、降脂、降糖等多種藥理活性［3-6］，其對細菌和真菌具有較好的抑制和殺滅作用［7］，臨床常用于口臭、口腔潰瘍、口腔炎等口腔疾病的預防及治療［8-11］。一枝黃花含漱劑是福建中醫藥大學附屬第二人民醫院制劑中心擬開發的中藥單方制劑，具有安全無毒、使用方便快捷、適用人群廣泛、價格便宜等特點。已有研究表明黃酮類和酚酸類成分是其抗菌消炎的主要藥效物質［3，12］，包括蘆丁、槲皮素、綠原酸等［13］。因此，為較全面地對一枝黃花含漱液質量進行控制，本研究采用薄層色譜法（TLC）對其進行定性鑒別；同時建立高效液相色譜法（HPLC）對一枝黃花含漱液中綠原酸、蘆丁、異槲皮苷與槲皮素4 個成分進行定量分析，以期為一枝黃花含漱液質量標準建立與院內制劑申報奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 儀器 戴安U3000 高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；超聲波儀（寧波新芝生物有限公司，型號：CLEAE01）；電子天平［奧豪斯儀器（常州）有限公司，型號：EX125ZH］；四孔加熱水浴鍋（上海力辰邦西儀器科技有限公司，型號：BHS-2）；低溫冷卻循環泵（上海亞榮生化儀器廠，型號：DLSB-6/20）；普通硅膠G 板（青島裕寶精細化工有限公司）；暗箱式三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司，型號：ZF-7）；超純水制造設備（四川卓越水處理設備有限公司）；調溫電熱套（北京永光明醫療器材有限公司，型號：DZTW）；電動薄層條帶狀點樣器（上?？普苌萍加邢薰?，型號：SP-Ⅲ）。

1.2 試藥 一枝黃花購自毫州市瀘譙藥業有限公司（批號：1903290222），經福建省第二人民醫院藥學部倪立堅主任藥師鑒定符合2020 年版《中華人民共和國藥典》規定；對照品綠原酸（純度96.1%，批號：110753-202018）、蘆?。兌?1.6%，批號：100080-202012）、異槲皮苷（純度97.2%，批號：111809-201804）、槲皮素（純度99.1%，批號：100081-201610）、一枝黃花對照藥材（批號：121433-201304）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。一枝黃花含漱液樣品及陰性制劑均為醫院制劑中心自制。阿斯巴甜（批號：W17032015）購自江蘇漢光甜味劑有限公司；安賽蜜（批號：2020055V）購自安徽維多食品配料有限公司；苯甲酸鈉（批號：23051203）購自湖南新綠方藥業有限公司。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液制備 取一枝黃花飲片30 g，加70%乙醇加熱回流，300 mL/次，提取3次，每次1.5 h，放冷，濾過，合并濾液，放四孔水浴鍋上加熱至無醇味，加入阿斯巴甜0.01 g、安賽蜜0.1 g 和苯甲酸鈉0.3 g，用純化水定容至100 mL，即得一枝黃花含漱液原液。精密量取一枝黃花含漱液原液20 mL 置水浴鍋加熱蒸干，殘渣加3 mL 甲醇溶解，過濾后取續濾液，作為供試品溶液，用于TCL 分析。取上述一枝黃花含漱液原液用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，用于HPLC 分析。

2.1.2 陰性供試品溶液制備 取阿斯巴甜0.01 g、安賽蜜0.1 g 和苯甲酸鈉0.3 g，用純化水溶解定容至100 mL，即得缺一枝黃花藥材陰性原液，后按“2.1.1”項下同法分別制成用于TCL 與HPLC 分析的陰性供試品溶液。

2.1.3 對照藥材溶液制備 取一枝黃花對照藥材約2 g，加入石油醚（60～90 ℃）50 mL，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，濾過，棄去石油醚液，藥渣揮干溶劑，加70%乙醇30 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加1 mL 甲醇溶解，作為對照藥材溶液，用于TCL 分析。

2.1.4 混合對照品溶液制備 取蘆丁對照品，加甲醇制成1 mg/mL 蘆丁對照品溶液，用于TCL 分析。分別精密稱取綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、槲皮素對照品適量，加甲醇分別制成1.080、1.248、0.832、0.720 mg/mL 單一對照品儲備液。分別精密吸取各對照品儲備液適量，加甲醇制成含上述4 個成分、濃度分別為216.00、624.00、41.60、36.00 μg/mL 的混合對照品溶液，搖勻，用于HPLC 分析。

2.2 TCL 法定性分析 參照《中華人民共和國藥典》2020 年版四部通則（0502）進行TCL 分析，吸取供試品溶液10、15 μL，蘆丁對照品溶液5 μL，對照藥材溶液與陰性供試品溶液各15 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（8∶1∶1∶1）為展開劑展開，取出，晾干，置紫外光燈365 nm 下檢視。結果表明：供試品色譜中，在與蘆丁對照品色譜和對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾，見圖1。

圖1 一枝黃花含漱液薄層色譜鑒別圖

2.3 HPLC 法定量分析

2.3.1 色譜條件 SinoChrom ODS-BP C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動相：0.05%磷酸乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～8 min，12%～20%A；8～15 min，20%～25%A；15～25 min，25%～35%A；25～40 min，35%～75%A；40～50 min，75%～12%A；50～60 min，12%～12%A；流速1 mL/min；檢測波長360 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。見圖2。

圖2 一枝黃花含漱液HPLC 圖

2.3.2 線性關系考察 取“2.1.4”項下的混合對照品溶液，稀釋為一系列梯度濃度的混合對照品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進行測定，進樣量為10 μL。以各化學成分進樣量（μg）作為橫坐標X，各成分峰面積作為縱坐標Y，繪制標準曲線并計算出各自的回歸方程與相關系數。結果表明：4 個成分在一定進樣量范圍內與峰面積呈較好的線性關系，見表1。

表1 一枝黃花含漱液中4 個化學成分的線性回歸方程

2.3.3 精密度試驗 精密吸取“2.1.1”項下的供試品溶液10 μL，按“2.3.1”項下色譜條件進行測定，連續進樣6 次，計算各組分峰面積RSD，結果顯示：供試品溶液色譜中綠原酸、蘆丁、異槲皮苷與槲皮素峰面積的RSD分別為1.57%、1.45%、1.50%、1.28%，表明該高效液相色譜儀精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 精密稱取一枝黃花藥材（批號：1903290222）6 份，按“2.1.1”項下方法制備成6 份一枝黃花含漱液。以“2.3.1”項下色譜條件分別進樣，計算綠原酸、蘆丁、異槲皮苷與槲皮素平均含量分別為63.22、159.5、10.35、10.50 μg/mL，各組分含量RSD 分別為1.54%、0.82%、1.27%、1.49%，表明該方法重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 精密吸取按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，25 ℃室溫放置，于0、2、4、6、12、24 h 分別按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄各組分峰面積，并計算綠原酸、蘆丁、異槲皮苷與槲皮素峰面積RSD 分別為1.80%、0.59%、1.62%、1.16%，表明供試品溶液在24 h 內穩定。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取一枝黃花藥材（批號：1903290222）6 份，按“2.1.1”項下方法平行制備6 份一枝黃花含漱液，每份取2 mL，分別加入適量“2.1.4”項下各單一對照品溶液，按“2.3.1”項下色譜方法進樣分析，計算加樣回收率。結果顯示：綠原酸、蘆丁、異槲皮苷與槲皮素的加樣回收率分別為99.12%、99.97%、98.46%、98.97%，各組分RSD分別為1.82%、1.27%、2.02%、2.28%。表明該方法準確性高，見表2。

表2 加樣回收率試驗結果

2.3.7 樣品含量測定 按“2.1.1”項下方法分別制成3 批次供試品溶液，并按“2.3.1”項下色譜條件分別進樣，記錄各組分峰面積，代入“2.3.2”項下方程計算一枝黃花含漱液中各待測組分含量，見表3。

表3 3 批次樣品含量測定表（n=3） μg/mL

3 討 論

3.1 薄層鑒別 在薄層色譜鑒別中對比了水提醇沉與乙醇加熱回流2 種提取方法，發現采用水提醇沉法所制備樣品在薄層色譜上斑點拖尾嚴重，分離度不理想，而乙醇回流提取方法能明顯改善上述現象。進一步對乙醇濃度進行考察，分別采用30%、50%、70%和純乙醇回流提取，發現70%乙醇提取的樣品在色譜上斑點分離度較好，與對照品以及對照藥材色譜相應位置上，觀察到相同顏色的斑點且顯色清晰，陰性無干擾。因此本試驗最終采用70%乙醇加熱回流提取樣品。

3.2 HPLC 法流動相選擇 參考文獻［14-15］，本次試驗共設計考察了0.1%甲酸甲醇-0.2%甲酸水、0.1%甲酸乙腈-0.2%甲酸水、0.05%磷酸乙腈-0.1%磷酸水溶液3 種不同的流動相體系。結果發現：0.1%甲酸甲醇-0.2%甲酸水色譜基線出現下漂現象且色譜峰表征數量較少；0.1%甲酸乙腈-0.2%甲酸水出現部分色譜峰的分離度較低；采用0.05%磷酸乙腈-0.1%磷酸水發現色譜峰分離度與峰形較好且基線平穩。

3.3 檢測波長選擇 參照文獻［16-17］，結合對比了5 種不同波長下一枝黃花含漱液色譜峰的表征效果，以一枝黃花藥典指標成分蘆丁峰面積大小為參照依據，發現在360 nm 波長下，4 個待測成分的色譜峰峰形對稱，分離度良好，因此最終確定以360 nm 波長作為本次HPLC 定量方法的檢測波長。

綜上，本實驗所建立的一枝黃花含漱液TLC 法鑒別的專屬性強，斑點清晰且陰性對照無干擾；建立HPLC 法同時測定一枝黃花含漱液中綠原酸、蘆丁、異槲皮苷與槲皮素4 個成分的含量，經精密度、穩定性、重復性與加樣回收率方法學考察驗證，該方法穩定性好，操作簡便，可為一枝黃花含漱液質量控制提供實驗依據。