中國莫勒菌代謝物的生物活性評價

邱振興， 賴芃宇， 朱志強， 譚 震， 邱君志， 陳宇熹?

(1.福州工商學院， 福建 福州 350715； 2.福建農林大學植物保護學院， 閩臺作物有害生物生態防控國家重點實驗室/生物農藥與化學生物學教育部重點實驗室， 福建 福州 350002)

莫勒菌(Moelleriella)是蟲生真菌的重要成員之一，該菌隸屬于子囊菌門(Ascomycota)糞殼菌綱(Sordariomycetes)肉座菌目(Hypocreales)麥角菌科(Clavicipitaceae)(Chaverriet al，2008)。 莫勒菌有易生產、高產孢量和高毒力等優勢，被認為是一種重要的生防制劑。1921 年，Berger 使用M.libera(無性型Aschersonia aleyrodis)防治佛羅里達柑橘粉虱，這是美國首次成功使用其進行害蟲生物防治(Qiuet al，2013)。 其后，許多研究相繼表明，莫勒菌物種可以防治粉虱和介殼蟲(Meekeset al，2002；Sengoncaet al，2006)。

在地球生物圈中，微生物扮演著極為重要的角色，與人類的日常生活存在緊密聯系。 蟲生真菌因其獨特的生活方式和生存環境，形成了與眾不同的適應寄主的特性及代謝通路。 近年來，已從蟲生真菌中分離出多種代謝物(Molnaret al，2010)，次生代謝產物被認為是在真菌感染期間起著至關重要作用的毒力因素(Sbarainiet al，2016)，這些代謝產物會引起昆蟲正常功能破壞、疾病甚至死亡(Aleksandraet al，2018)。

莫勒菌廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區，該類群因棲息環境和生態適應的多樣性使其次生代謝產物彰顯出多樣性特點。 有研究表明，從莫勒菌(M.tubulata)中分離得到了多種化合物，其中杜斯塔寧和3β-乙?；?15α，22-二羥何帕烷酮能顯著抑制結核桿菌(Boonphonget al，2001)。 另有學者從莫勒菌代謝物中分離得到了1 種三萜類物質——澤渥萜(Beemelmannset al，2016)。 此外，Wattset al(2003)從莫勒菌的菌株中獲得了對昆蟲細胞Sf9 顯示出很強的抑制作用的細皺青霉素和醌茜素，其半數抑制量(ID50)分別為1.2 和9.6 μg?mL－1。 Isakaet al(2005)從1 株莫勒菌(無性型Aschersoniasp. BCC8401)中分離到氧雜蒽酮二聚體Ascherxanthone A，此物質對瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的生長有顯著抑制作用，其半抑制濃度(IC50)為0.2 μg?mL－1。 Isakaet al(2010)分離到多種莫勒菌(無性型A.paraphysataBCC11964)的次生代謝產物，其中化合物Aschernaphthopyrones A 和17(21)-藿烯-6，12β-二醇對腫瘤細胞(人乳腺癌細胞MCF-7、人肺癌細胞NCI-H187、口腔表皮樣癌細胞KB)和瘧原蟲表現出較強的抑制作用，IC50分別為7.3 和15 μmol?L－1。 潘潔茹等(2007)發現1 株莫勒菌(無性型座殼孢)的代謝產物具有廣譜抗細菌的活性，馬慧斐等(2007)報道1 株莫勒菌(無性型座殼孢)對Raji 淋巴瘤細胞的增殖具有顯著的抑制作用，Liuet al(2015)發現了莫勒菌產生的7 個新羊毛甾烷型三萜，并測試其活性，其中1-hydroxy-2-hydroxymethyl anthraquinone具有較好的抗瘧效果，付德來等(2018)報道了莫勒菌含有萜類、醌類、黃酮類、甾醇和環肽等化合物并具有抗菌、抗腫瘤及殺蟲等活性。 由此可見，莫勒菌及其無性型天然產物有較好的抗菌、殺蟲、抗瘧、抗腫瘤細胞活性，該菌在生物農藥或醫藥應用領域存在巨大潛力。 Wattset al(2003)就11 個座殼孢菌和7 個莫勒菌代謝產物對昆蟲和哺乳動物細胞毒性的安全性進行評測，結果表明，代謝物對昆蟲細胞顯示出較強的毒性，對哺乳動物細胞幾乎無影響。 這表明，莫勒菌的代謝物相對安全，具有開發潛力。

本研究針對前期試驗獲得的莫勒菌純化合物進行抗菌、抗氧化活性評價，以期發現該菌次生代謝化合物的應用價值，為其開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

鏈霉素和2，6-二叔丁基對甲酚(BHT)購于上海麥克林生化材料有限公司；總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑、超氧陰離子自由基(?)測定試劑盒、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力試劑盒和2，2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基清除能力檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗菌株和化合物

試驗菌株為中國莫勒菌(Moelleriella sinensisWYQL2017-03)，由本課題組自主分離純化和鑒定。

用于抑菌活性評價的細菌和真菌共有12 種，均為本實驗室保存菌株，大腸桿菌(Escherichia coli)、青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、尖孢鐮刀菌西瓜?；?Fusarium oxysporumf. sp.niveum)、鏈格孢屬(橄欖) (Alternania)、鏈格孢屬(花生) (Alternania)、炭疽屬(橄欖)(Colletrotrichum)、間座殼屬(多花黃精)(Diaporthe)、擬盤多毛孢屬(花生)(Pestalotiopsis)、擬盤多毛孢屬(蓮霧)(Pestalotiopsis)、擬盤多毛孢屬(橄欖)(Pestalotiopsis)。

從中國莫勒菌的乙酸乙酯萃取物中得到的20 個純化合物如表1 所示。

1.3 體外抗菌活性評價

在超凈工作臺內將供試菌株接種于150 mL 裝有滅過菌的液體培養基的錐形瓶中并密封，利用恒溫搖床在培養基中活化(細菌為LB 培養基，真菌為PDB 培養基)，供試細菌于恒溫培養箱(28 ℃)中培養24 h 至對數期，用酶標儀測定600 nm 下的吸光度(OD 值)，換算得到相應的濃度，最終將濃度稀釋至試驗所需濃度1×106CFU?mL－1。 供試真菌需利用恒溫培養箱(28 ℃)培養5～7 d 后，取培養好的真菌平板，用移液槍加入3 mL 無菌水，將菌絲輕輕刮取下來，使得真菌孢子懸浮于無菌水中，吸取孢子懸浮液于無菌EP 管中沉淀細小菌絲。 采用血球計數板測算孢子懸浮液的濃度，稀釋至1×105個?mL－1備用。

將準備好的供試菌液用移液槍吸取196 μL 加入96 孔板的第1 孔中，第2～8 孔每孔加入菌液100 μL。 第1 孔再加入配制好的待測液體(1 mg?mL－1)4 μL，用移液槍吹打混勻，每組試驗均設3 組重復，陽性對照為鏈霉素和環丙沙星，陰性對照為二甲基亞砜(DMSO)。

采用二倍稀釋法，用移液槍吸取100 μL 第1 孔中混勻的菌液與化合物液體注入第2 孔，混勻后吸取100 μL 第2 孔液體加入第3 孔，以此類推至第8 孔，第8 孔內液體混勻后吸取100 μL，棄之。 最后在1～8 各孔中加入菌液100 μL，使每孔的總體積200 μL，對96 孔板密封處理后放置恒溫培養箱培養，細菌培養24 h，真菌培養5～7 d，用酶標儀于600 nm 下測OD 值，與空白對照組作比較，吸光度下降50%時的樣品濃度確定為最小抑菌濃度(MIC)。

1.4 抗氧化活性測定

1.4.1 總抗氧化能力(T-AOC)測定 根據總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒說明書配制不同濃度標準品溶液，稱取27.8 mg FeSO4?7H2O，用1 mL 蒸餾水溶解，即濃度為100 mmol?L－1，將液體依次稀釋至0.15、0.30、0.60、0.90、1.20 和1.50 mmol?L－1。 充分混勻后，37 ℃避光靜置5 min，用酶標儀測定605 nm 處的吸光度。 各孔減去空白孔OD 值后，以標準品OD 值為橫坐標，縱坐標為各OD 值對應的標準品溶液濃度，得線性回歸方程y＝3.7855x－0.0627(R2＝0.9985)。 把樣品測定管測得的OD 值減去空白孔OD 值后，代入標準曲線計算公式，求得總抗氧化能力。

1.4.2 超氧陰離子清除活性測定 根據抑制與產生超氧陰離子自由基測定試劑盒說明書配制樣品溶液和對照溶液，將待測溶液用漩渦混勻器充分混勻，置37 ℃恒溫水浴40 min，室溫靜置10 min，雙蒸水調零，用酶標儀測定550 nm 處的吸光度(A)。 計算待測樣品對超氧陰離子的抑制率。

1.4.3 DPPH 自由基清除活性測定 根據DPPH 自由基清除能力試劑盒配制樣品溶液和對照溶液，將待測溶液充分混勻，室溫25 ℃避光靜置30 min，4000 r?min－1離心5 min 后吸取上清液，用酶標儀測定517 nm 處的吸光度(A)。 計算待測樣品對DPPH 自由基清除率。

1.4.4 ABTS 自由基清除能力測定 根據ABTS 自由基清除能力檢測試劑盒配制樣品溶液和對照溶液，將待測溶液充分混勻，室溫25 ℃避光靜置6 min。 用酶標儀測定405 nm 處的吸光度(A)。 計算陽性對照的自由基清除率(DVC)和樣品的自由基清除率(D)。

2 結果與分析

2.1 抑菌活性評價結果

20 個化合物中僅7 個化合物(4、5、7、8、11、12、14)表現出不同程度的抗菌活性。 20 個化合物對7 株植物病原真菌均未表現出抑制活性，對4 株細菌和1 株真菌的抑制活性如表2 所示。 化合物14 對大腸桿菌和青枯勞爾氏菌的MIC 分別為1.30 和6.25 μg?mL－1，抑菌活性超過陽性對照鏈霉素；化合物5 對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的MIC 值均為10.00 μg?mL－1；化合物11 對5 株菌株均展示出不同程度的抑制活性，MIC 為6.25～25.00 μg?mL－1。

表2 中國莫勒菌代謝物的抗菌活性Table 2 Antibacterial activities of compounds from M. sinensis

2.2 抗氧化活性評價結果

采用4 種方法(超氧陰離子清除能力、DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、T-AOC總抗氧化能力)對純化合物進行抗氧化活性評價，20 個化合物中僅化合物3、8、11、19 表現出抗氧化活性(圖1－圖4)。 清除自由基的能力因化合物而異，由于取代基的不同，活性也會變化。 化合物19 對超氧陰離子自由基的清除能力最高(50 μg?mL－1時抑制率為7.15%)，化合物3對DPPH、ABTS 自由基的清除能力最高(50 μg?mL－1時清除率分別為66.02%、30.75%)，化合物19 的總抗氧化能力最強(50 μg?mL－1濃度相當于0.63 mmol?L－1FeSO4的抗氧化能力)。

圖1 部分中國莫勒菌代謝物對超氧陰離子自由基的清除作用Figure 1 Superoxide radical scavenging effects of some compounds from M. sinensis

圖2 部分中國莫勒菌代謝物對DPPH自由基的清除作用Figure 2 DPPH radical scavenging effects of some compounds from M. sinensis

圖3 部分中國莫勒菌代謝物對ABTS自由基的清除作用Figure 3 ABTS radical scavenging effects of some compounds from M. sinensis

圖4 部分中國莫勒菌代謝物的總抗氧化能力(T-AOC)Figure 4 Total antioxidant capacity of some compounds from M. sinensis

3 討論

在抗菌活性評價試驗中，化合物5、11 和14 抗菌活性較為突出，化合物14 對大腸桿菌和青枯勞爾氏菌的MIC 值超過陽性對照鏈霉素。 化合物11 對5 株不同細菌和真菌表現出不同程度的抑制活性，具有相對廣泛的抗菌活性。 對分離得到的抗菌活性物質進行分析發現，萜類化合物12、14 對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、青枯勞爾氏菌)的抑制活性明顯優于革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)。 由此可見，這些化合物具有較好的應用潛力。 化合物種類不同，與細菌的相互作用機制也不同。 有研究者對化合物5 進行過初步構效關系分析，認為苯環上的羥基可能是其對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌產生抗菌活性以及甲基化的關鍵，羥基可能會降低抗菌活性(Huanget al，2018)。 有研究表明，某些萜類化合物可以通過破壞細菌胞內微絲結構，提高細胞膜通透性，從而達到抑菌效果，這種活性作用的強度大多受雙環母核上取代基位置影響(Lyuet al，2023)；還有研究發現，酮類化合物可逆性地結合細菌的50S蛋白質亞單位，導致細菌蛋白質合成受阻。 研究表明，天然產物之所以具有抑菌活性，可能是因為多物質之間通過配伍作用發揮效果，例如頭孢他啶耐藥性陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)可被芹菜素(黃酮)與頭孢他啶協同抑制(司旭等，2015)，這可以作為后續深入研究的方向。 從該菌次生代謝產物分離得到的酚酸類、三萜類、內脂類衍生物都有不同程度的抗細菌活性，為生物抗菌藥劑的研發提供了新穎思路和科學依據。

在抗氧化能力評價中，表現出明顯抗氧化活性的4 個化合物中，有3 個為萜類化合物，其中萜類化合物3(三萜)、19(二萜)抗氧化活性更為突出。 同種化合物在不同抗氧化能力評價試驗中存在差異，可能是不同反應機制造成的。 超氧陰離子法、DPPH 法以及ABTS 法都是通過檢測特征自由基的形成或衰減的速度或程度來評價樣本活性。 以ABTS 法為例，有些化合物清除ABTS 自由基后的產物也能與ABTS 自由基反應，若如此，則測得的結果為被測化合物和反應產物與ABTS 自由基反應的總和。 而鐵離子還原抗氧化劑能力(FRAP)法真正評測的是被測物將Fe3＋還原成Fe2＋的能力，還原Fe3＋的能力可以反映化合物的抗氧化能力，但是能還原Fe3＋的并不一定都是抗氧化劑，抗氧化劑不一定能有效地還原Fe3＋(王會等，2006)。 總的來說，各種測定方法都存在片面性，需要通過歸納各個結果的共性才能得到合理化評價。