亞臨界R134a萃取樟樹葉精油的工藝優化及抑菌研究

胡 珊, 梁衛驅, 謝佩吾, 羅華建, 連輝明, 黃 皓*

(1.東莞市農業科學研究中心,廣東 東莞 523083; 2.廣東省林業科學研究院廣東省森林培育與保護利用重點實驗室,廣東 廣州 510520)

1 材料與方法

1.1 原料、試劑和儀器

新鮮樟樹(Cinnamomumcamphora(L.) Presl)枝葉,由廣東華清園生物科技有限公司提供;馬鈴薯瓊脂(PDA)培養基,廣東環凱微生物科技有限公司;辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.cubense)、冬瓜枯萎病菌(F.oxysporum(Schl.) f.sp.benincasae)、水稻稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、西瓜炭疽病菌(Colletorichumorbiculare)、甘蔗赤腐病菌(C.falcatum)、玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)、蘋果輪紋病菌(Physalosporapiricola)、花生褐斑病菌(Cercosporaarachidicola)均由華南農業大學植物病理系提供。1,1,1,2-四氟乙烷(R134a)(純度≥99.9%)、無水乙醇(分析純)、聚山梨酯80(化學純),均為市售。

GC-MS-QP2020 W/O氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)儀,日本島津公司;CBE-10L亞臨界流體萃取實驗室成套設備,河南省亞臨界生物技術有限公司;Hei-VAP Advantage/ML/G3旋轉蒸發儀,德國海道爾夫公司。

1.2 樟樹葉亞臨界R134a萃取

1.2.1新鮮樟樹葉干燥處理方法 新鮮樟樹葉均勻擺盤后,厚度以不超過烘盤邊框為宜。采用空氣能熱泵設備在60 ℃、相對濕度≤50%的條件下干燥4～6 h(烘干時間根據枝葉量多少會有少許不同)。新鮮樹葉含水率約為51%～52%,烘干后含水率約為4.5%～4.8%。將干葉真空包裝后放置于陰涼干燥處備用。

1.2.2單因素試驗 試驗因素分別為:原料粒度、液料比、萃取溫度、萃取時間和萃取次數。研究某一因素影響時,其他因素取固定值。初始萃取工藝為:稱取2 mm孔徑篩網粉碎得到的原料1 kg裝入濾袋,置于亞臨界萃取設備中,在液料比7∶1(L∶kg,下同)、萃取溫度40 ℃的條件下重復萃取4次,每次40 min。所得萃取物用20倍體積的無水乙醇溶解,于-18 ℃下冷凍24 h,過濾,除去不溶的蠟質、纖維等成分,濾液經旋轉蒸發(40 ℃,0.01 MPa),得樟樹葉精油,計算得率[15-16]。

1.2.3正交試驗 為確定最佳萃取工藝條件,選取萃取溫度(40、 45和50 ℃)、萃取時間(30、 40和50 min)、萃取次數(2、 3和4次)3個因素,采用L9(34)正交試驗設計,以樟樹葉精油得率為考察指標,優化樟樹葉精油亞臨界R134a萃取工藝,精油的萃取流程及得率計算同單因素試驗。

1.3 樟樹葉水蒸氣提取

采用《中華人民共和國藥典》(2015版)附錄XD水蒸氣蒸餾法提取樟樹葉精油。為減少揮發,采摘回實驗室的鮮葉需在1周內完成精油提取工作,鮮葉每份稱量400 g,提取液料比為3∶1(mL∶g),提取時間為2 h[17]。所得精油在0～5 ℃條件下保存,用于精油成分分析和抑菌作用研究。

1.4 樟樹葉精油化學成分測定

氣相色譜條件采用SH-Rxi-5Sil MS石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),升溫程序為初始柱溫70 ℃,以2 ℃/min速率升溫至160 ℃,保持2 min,再以10 ℃/min速率升溫至220 ℃保持5 min,全程共運行51 min。進樣口溫度230 ℃,進樣量0.5 μL,分流比為100∶1,載氣為He(純度99.99%)。質譜條件采用電離源為EI,電離電壓70 eV,離子源溫度200 ℃,接口溫度250 ℃,范圍為50～500m/z[18]。

1.5 樟樹葉精油抑菌作用分析

參考文獻[19]的方法,在無菌條件下,將樟樹葉精油用2%吐溫80乳化劑溶液稀釋為300 mg/L。采用PDA平板對峙法進行樟樹葉精油抑制作用測試,用6 mm打孔器打取植物病原真菌菌餅移入到PDA平板中央,在距菌餅約2 cm處等距離呈等邊三角形的三點打孔,每個孔內加100 μL樟樹葉精油溶液,每個處理3次重復,以2%吐溫80乳化劑溶液為陰性對照,不添加任何物質的處理為空白對照。所有處理平板均放置28 ℃中培養至空白對照菌落長滿,測量菌落直徑。

[書籍] 序號 作者.書名[M].譯者.版次.出版地：出版單位(國外出版單位可用標準縮寫不加縮寫點)，出版年：起止頁碼.

1.6 數據處理方法

采用Origin 8.0作圖,采用SPSS 26.0及Microsoft Excel 2007軟件對數據進行分析,試驗數據為平均值±標準差。采用單因素方差分析(One-way ANOVA),以最小顯著性差異法(LSD)多重比較檢驗不同處理之間的差異顯著性(α=0.05)。

2 結果與討論

2.1 精油萃取的單因素試驗結果

2.1.1原料粒度 干燥后的樟樹葉分別采用粗碎機和粉碎機處理,粉碎原料粒度明顯小于粗碎。不同粒度的原料經亞臨界R134a萃取后的精油得率見表1。粉碎原料的精油得率顯著高于粗碎原料,經不同孔徑篩網粉碎得到的原料之間精油得率也有顯著差異,其中采用2 mm孔徑篩網粉碎得到的原料精油得率最高,為(2.60±0.07)%。因此,選擇2 mm孔徑篩網粉碎得到的原料作為后續優化試驗的原料粒度。

表1 原料粒度對亞臨界R134a萃取樟樹葉精油得率的影響Table 1 Effects of raw material granularity on the yield of essential oil from C.camphora leaves by subcritical R134a extraction

2.1.2液料比 根據萃取罐容量及裝料量,最大液料比為7∶1,將原料浸沒的最小液料比為5∶1。液料比單因素試驗結果見圖1(a),液料比對精油的萃取得率有顯著影響,適當增大液料比可提升精油得率,當液料比大于6∶1時,得率提升不顯著,且會增加溶劑的回收時長和能耗,因此選擇6∶1做為后續優化試驗的液料比。

a.液料比liquid-solid ratio;b.萃取溫度extraction temperature;c.萃取時間extraction time;d.萃取次數extraction times圖1 提取條件對亞臨界R134a萃取樟樹葉精油得率的影響Fig.1 Effects of extraction conditions on the yield of essential oil from C.camphora leaves by subcritical R134a extraction

2.1.3萃取溫度 根據萃取設備工作壓力范圍,以5 ℃為梯度選取最高不超過50 ℃的4個溫度進行萃取試驗,結果見圖1(b)。萃取溫度對萃取效果有顯著影響,適當提高萃取溫度可提升精油得率,溫度超過45 ℃時精油得率提升效果不顯著,綜合考慮,萃取溫度選擇40～50 ℃較為適合。

2.1.4萃取時間 萃取時間單因素試驗結果見圖1(c)。在固定萃取次數(4次)條件下,單次萃取時間30與40 min時的精油得率無顯著差異,相對20 min有顯著差異,50和60 min無顯著差異。相對于單次萃取時間為30 min,在萃取時間延長1倍的條件下精油得率僅有小幅提升(約9.4%)。綜合考慮,單次萃取時間選擇30～50 min較為適合。

2.1.5萃取次數 萃取次數單因素試驗結果見圖1(d)。萃取次數對萃取效果有顯著影響,萃取2次(得率約2.51%)相對于萃取1次(得率約0.93%),精油得率有極顯著的提升(提升約170%,P<0.01),之后逐漸增加萃取次數,得率提升幅度均較小,萃取5次相對于2次僅提升13.5%,但大大增加了工序的繁瑣程度及能耗,綜合考慮,次數選擇2～4次較為適合。

2.2 精油萃取的正交試驗結果

正交試驗方案及結果見表2,影響得率的主次因素依次為萃取次數>萃取時間>萃取溫度,最佳工藝為原料粒徑≤2 mm,液料比為6∶1,萃取溫度45 ℃,萃取時間40 min/次,萃取4次。表3方差分析結果表明萃取次數對精油得率影響極顯著(P<0.01),萃取時間影響顯著(P<0.05),萃取溫度影響不顯著(P>0.05),對精油得率影響的主次順序與極差分析結果一致。在最佳工藝條件下進行樟樹葉精油萃取重復試驗,得率為(2.87±0.08)%。

表2 正交試驗方案設計及結果Table 2 Orthogonal experimental scheme design and results

表3 方差分析結果Table 3 Variance analysis results

2.3 不同方法提取精油的化學成分對比

利用GC-MS對2種方法提取所得的樟樹葉精油進行化學成分分析,總離子流色譜見圖2。使用峰面積歸一化法確定各化學成分的相對峰面積,分析結果見表4。

a.水蒸氣提取steam extraction;b.亞臨界R134a萃取subcritical R134a extraction圖2 樟樹葉精油的GC-MS總離子流色譜Fig.2 GC-MS total ion chromatogram of C. camphora leaf essential oil

水蒸氣提取和亞臨界R134a萃取得到的2種樟樹葉精油中分別鑒定出39和35種化合物,相對總峰面積分別為99.97%和99.91%。2種葉精油的化學組分均以醇類和烴類化合物為主,其中醇類分別有10種和8種,相對峰面積分別為70.48%和65.58%;烴類分別有24種和20種,相對峰面積分別為22.48%和23.41%;除此以外,2種精油中還檢測出酮類化合物分別為3種和5種,酯類化合物均為2種。

2種葉精油共同鑒定出的化合物有27種,其中烴類化合物15種,醇類化合物7種,酯類化合物2種和酮類化合物3種。龍腦是2種葉精油的主要化學成分,其在水蒸氣提取精油的相對峰面積(64.29%)大于亞臨界R134a萃取精油(58.09%)。

樟樹精油中的非龍腦成分如石竹烯、樟腦、檸檬烯等也是醫藥、化工等行業的重要原料。2種葉精油中非龍腦化學成分的相對峰面積分別為35.58%和41.82%。水蒸氣提取葉精油中相對峰面積超過1%的非龍腦化學成分有14種,分別為α-蒎烯、莰烯、檜烯、β-蒎烯、D-檸檬烯、石竹烯、α-石竹烯、大根香葉烯D、桉葉油醇、松油烯-4-醇、α-松油醇、樟腦、乙酸龍腦酯和乙酸橙花叔醇酯;亞臨界R134a萃取葉精油中相對峰面積超過1%的非龍腦化學成分有12種,分別為石竹烯、α-石竹烯、大根香葉烯D、氧化石竹烯、 4(14),11-桉葉二烯、異丁子香烯、桉葉油醇、α-松油醇、桉油烯醇、樟腦、蒿酮和乙酸龍腦酯。

2.4 不同方法提取精油的抑菌作用

采用平板對峙法測定2種方法提取樟樹葉精油對植物病原真菌的抑制作用,結果見表5。亞臨界R134a萃取樟樹葉精油對9種植物病原菌均有不同程度的抑制作用,水蒸氣提取樟樹葉精油除對蘋果輪紋病菌沒有抑制作用外,對其余8種植物病原菌均有不同程度的抑制作用。從表5可見,2種樟樹葉精油對不同真菌的抑菌率相差較大,亞臨界R134a萃取樟樹葉精油對病原真菌的抑菌效果優于水蒸氣提取精油。其中,亞臨界R134a萃取樟樹葉精油對9種病原真菌抑制率在43.22%～71.74%之間,水蒸氣提取樟樹葉精油對8種病原真菌抑制率在18.96%～62.87%之間,2種樟葉精油均對辣椒疫霉病菌的抑制率最高。

植物精油的抑菌活性強弱與其化學組分密切相關。Kalemba等[20]總結了植物精油功能基團抗菌活性的強弱排序為酚類>肉桂醛>醇類>醛類=酮類>酯類>碳氫化合物類。2種樟樹葉精油的化學成分均為醇類、烴類、酮類、酯類4類化合物,主要成分為醇類化合物,其相對峰面積是水蒸氣提取樟樹葉精油高于亞臨界R134a萃取樟樹葉精油,其余3類化合物的相對峰面積均為亞臨界R134a萃取樟樹葉精油高。此外,已有研究表明,龍腦對白色念珠菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等細菌,異常漢遜氏酵母菌和球毛殼霉均有一定的抑制作用,其他成分如檸檬烯、β-水芹烯、α-蒎烯等也具有不同程度的抗菌活性[21-23]。因此,樟樹葉精油的抑菌作用可能是各種成分的協同效果,這與胡文杰等[24]研究結果一致。

3 結 論

3.1以R134a為萃取溶劑,采用亞臨界流體萃取樟樹葉精油,通過正交試驗優化得到最佳工藝條件為原料粒度≤2 mm,液料比為6∶1(L∶kg),萃取溫度45 ℃,萃取時間40 min/次,萃取4次,精油得率為(2.87±0.08)%。影響得率的主次因素依次為萃取次數>萃取時間>萃取溫度。

3.2比較研究亞臨界R134a萃取和水蒸氣提取2種方法得到的樟樹葉精油化學成分差異和抑菌活性,GC-MS分析2種葉精油分別鑒定出39和35種化合物,相對總峰面積分別為99.97%和99.91%。

3.32種葉精油的化學組分均以醇類和烴類化合物為主,龍腦是2種葉精油的主要化學成分,水蒸氣提取精油的龍腦相對峰面積(64.29%)大于亞臨界R134a萃取精油(58.09%)。

3.42種葉精油對辣椒疫霉病菌、花生褐斑病菌等9種植物病原菌均有不同程度的抑制作用,亞臨界R134a萃取樟葉精油對病原真菌的抑菌效果均優于水蒸氣提取精油。2種葉精油均對辣椒疫霉病菌的抑制率最高,分別為71.74%和62.87%。