海巴戟果實多糖的結構特征及體外抗氧化活性研究

王青芬, 敖新宇, 宮樹森, 劉 瑯, 刀 梅, 吳 田*

(1.西南林業大學 園林園藝學院;國家林業和草原局西南風景園林工程技術研究中心;云南省功能性花卉資源及產業化技術工程研究中心,云南 昆明 650224;2.西南林業大學 文法學院,云南 昆明 650224)

海巴戟(Morindacitrifolia)又稱諾麗,學名海濱木巴戟,茜草科巴戟天屬,原產于南太平洋諸島,在我國分布于云南、海南等地區。海巴戟根、莖、葉和果實均可入藥[1],用于治療多種病癥,如感染、關節炎和哮喘等[2]。2010年,海巴戟果漿被我國衛生部列入了新資源食品名單,其保健價值日益受到人們的關注。多糖是海巴戟中含量較高的一種活性成分。多糖是通過糖苷鍵連接形成的鏈狀高分子碳水化合物,廣泛存在于自然界中,其結構復雜多樣,不僅是生物體的重要組成部分,還具有抗氧化[3]、抗衰老[4]、免疫調節[5]、抗炎[6]、抗腫瘤[7]等生物活性。沈曉靜等[8]通過體外抗氧化實驗測定咖啡花多糖對ABTS自由基、DPPH自由基的清除率以及Fe2+還原力,結果表明咖啡花多糖具有一定的抗氧化活性。王曉敏等[9]研究表明山藥多糖的抗氧化活性顯著高于Vc,具有較好的體外抗氧化活性。有研究指出,多糖的生物活性與結構特征有密切關系,而且多糖結構復雜多樣,使多糖的結構研究備受關注[10]。

自由基是人體在氧化反應中產生的有害物質,能損傷人體的組織和細胞,并引起慢性疾病和衰老?？寡趸锟梢郧宄杂苫?使生物體保持健康狀態。目前,市面上大部分抗氧化劑都是通過人工合成而來的,具有毒害作用,會引起肝損傷及致癌風險[11]。而天然的抗氧化劑毒性小、易獲取,從天然植物中篩選清除體內自由基的天然抗氧化劑具有重要的實際意義。左麗敏等[12]通過超聲波提取法提取海巴戟果實多糖,用不同體積分數的乙醇醇沉得到粗多糖,并測定其對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基清除率,發現70%乙醇醇沉海巴戟多糖的抗氧化活性最強。超聲波提取過程中,超聲波會破壞植物的細胞壁,可能會影響多糖的結構和功能。而熱水浸提法成本低、操作簡便,并且對多糖分子的破壞小,被廣泛應用于植物多糖的提取。本研究以熱水浸提法提取海巴戟果實粗多糖并進行純化,用紅外光譜、核磁共振以及氣相色譜-質譜聯用技術分析純化多糖的結構特征,并測定海巴戟粗多糖和純化多糖清除自由基的能力和還原能力,以期進一步開發海巴戟果實多糖在天然抗氧化劑領域的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

海巴戟(MorindacitrifoliaL.),成熟的果實采集于云南省元江市海巴戟標準化種植基地,將采收的果實用純水沖洗之后、擦干表面水分、切片,置于60 ℃鼓風干燥箱中烘干,粉碎成果粉,過0.15 mm篩,裝入自封袋中,放于60 ℃干燥器中保存備用。ABTS、DPPH,美國Sigma公司;抗環血酸(Vc)等其他試劑均為國產分析純。

FT-IR 650傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀,天津港東科技發展股份有限公司;QP2010 plus氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)儀,日本島津公司;Bruker 600M核磁共振波譜(NMR)儀,德國Bruker公司;TU1901紫外分光光度計,北京普析有限公司。

1.2 海巴戟果實多糖的提取及純化

稱取500 g的海巴戟果實干粉,參照袁海華等[13]所得最優提取工藝提取海巴戟果實多糖,加入無水乙醇使最終體積分數為80%進行醇沉,Sevage法除蛋白,得到粗多糖。采用AB-8大孔樹脂脫色,運用DEAE Sepharose Fast Flow凝膠柱分離純化,用蒸餾水洗脫得到純化多糖。

1.3 多糖結構分析

1.3.1FT-IR分析 稱取多糖樣品2 mg、溴化鉀200 mg研磨,壓制成透明的圓形薄片,通過FT-IR儀進行掃描,波數范圍400～4 000 cm-1。

1.3.2GC-MS分析 分析之前先進行甲基化處理。將多糖樣品放入反應瓶中,加入DMSO后快速加入NaOH粉末,封閉反應瓶,超聲波溶解后,再加入碘甲烷進行甲基化反應,最后加入蒸餾水終止反應。取甲基化后的樣品進行乙?；?采用GC-MS儀測定乙?；a物樣品。GC分析的色譜柱的條件為RXI-5 SIL MS色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),程序升溫:起始溫度130 ℃,3 ℃/min升溫至250 ℃,保持10 min,進樣口溫度為250 ℃,檢測器溫度為250 ℃,載氣為氦氣,流速為3 mL/min。質譜掃描范圍 40～500 u,間隔時間0.2 s,以高純氦氣為載氣,溶劑延遲3 min。

1.3.31H NMR分析 取100 mg的多糖樣品溶于0.5 mL的D2O中,TMS為內標。通過NMR波譜儀在25 ℃下進行樣品測定,收集1H NMR的光譜信號。1H NMR是在小化學位移范圍內分析多糖結構,主要是判斷多糖中糖殘基數、糖環構型以及異頭構型等。

1.4 體外抗氧化活性試驗

1.4.1對ABTS自由基(·ABTS+)清除能力 根據Re等[14]的方法稍作改動?！BTS+工作液配制:將14 mmol/L ABTS、 4.90 mmol/L過硫酸鉀等體積混合后避光、室溫條件下反應16 h,反應完成后用甲醇適當稀釋,使其在波長734 nm處吸光度值為0.700±0.002。取1.0 mL不同質量濃度的多糖樣品溶液,加入2.0 mL·ABTS+工作液,混勻,室溫下反應10 min,用紫外分光光度計于734 nm處測定吸光度值,以Vc為陽性對照?！BTS+清除率(η·ABTS+)計算公式如下:

η·ABTS+=(1-(A1-A2)/A3)×100%

式中:A1—1.0 mL多糖溶液+2.0 mL·ABTS+工作液的吸光度值;A2—1.0 mL多糖溶液+2.0 mL蒸餾水的吸光度值;A3—1.0 mL蒸餾水+2.0 mL·ABTS+工作液溶液的吸光度值。

1.4.2對DPPH自由基(DPPH·)清除能力 根據文獻[15]報道的方法稍作修改。取1.0 mL不同質量濃度的多糖樣品溶液,分別加入2.0 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液,混勻,暗反應40 min。暗反應完成后,于波長517 nm處測定吸光度值,以Vc為陽性對照。DPPH·清除率計算公式同1.4.1節。

1.4.3對羥基自由基(·OH)清除能力 根據Acker等[16]報道的方法稍作修改。取1.0 mL不同質量濃度的多糖樣品溶液,依次加入1.0 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、 1.0 mL 9 mmol/L H2O2溶液、 1.0 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液,在37 ℃下水浴30 min后,取出試管并在波長510 nm處測定吸光度值,以Vc為陽性對照?！H清除率計算公式同1.4.1節。

2 結果與分析

2.1 海巴戟果實多糖的提取與純化結果

根據袁海華等[13]最佳提取工藝提取粗多糖,得到粗多糖47.38 g,提取得率為9.48%。通過大孔樹脂脫色,得到脫色后的多糖20.36 g,經過蒸餾水洗脫得到均一的純化多糖,質量為1.77 g,純化多糖得率為0.35%。

2.2 純化多糖的結構分析

圖1 純化多糖的紅外光譜 圖2 純化多糖衍生物的總離子流色譜Fig.1 FT-IR spectrum of purified polysaccharides Fig.2 Total ion current chromatography of purified polysaccharides derivatives

糖醛酸是多糖抗氧化活性的有效指標,糖醛酸含量與植物抗氧化性呈正相關[22]。紅外光譜分析發現純化多糖中含有糖醛酸,表明獲得的海巴戟純化多糖具有抗氧化性。

2.2.2GC-MS分析 將純化多糖經過甲基化、水解、還原及乙?；蟮玫降漠a物,利用GC-MS分析,得出純化多糖衍生物的總離子流色譜見圖2。圖中得到6個主要的離子流峰,對6個峰進行提取,對比標準數據庫進行分析,得到純化多糖糖基的連接方式及各種鍵型的比例見表1。

表1 海巴戟果實純化多糖的GC-MS分析結果1)Table 1 GC-MS analysis results of purified polysaccharides from M. citrifolia fruit

由表1可知,純化多糖的連接方式主要以→4)-吡喃葡萄糖-(1→和非還原末端的吡喃葡萄糖為主,另外還含有→3,6)-吡喃半乳糖-(1→、→3)-吡喃半乳糖-(1→、→2,6)-吡喃甘露糖-(1→以及少量的→6)-吡喃半乳糖-(1→,通過積分計算面積得出這6種連接方式的物質的量比約為0.248∶0.212∶0.181∶0.138∶0.135∶0.086。由于海巴戟果實純化多糖結構中含有→2,6)-吡喃甘露糖-(1→和→3,6)-吡喃半乳糖-(1→,可以初步推測純化多糖中可能含有分支結構。本研究得到的海巴戟純化多糖為均一的多糖,其分子質量為5 213 u,主要由葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成,以半乳糖和甘露糖為主。

2.2.31H NMR分析 由圖3可以看出,δ3.2～4.2間的信號是非異頭氫的CH2和CH的信號,重疊嚴重,一般是不能給出有效的結構信息。在δ5.0～5.5和δ4.5～5.0都存在化學位移,因此可以確定海巴戟多糖中既存在α-型糖苷殘基,也存在β-型糖苷殘基[23]。δ4.69處的峰為溶劑D2O峰,而屬于異頭氫的化學位移有δ4.86、 4.87、 4.95、 4.96、 5.18、 5.19、 5.26、 5.33、 5.36、 5.46和5.47。由此表明:海巴戟果實純化多糖主要為β-型糖苷,同時還有少量α-型糖苷。常相娜等[24]通過NMR分析得出融水香菇多糖為β型的吡喃多糖;向瑞琪等[25]通過水提醇沉法提取香菇、黑木耳和紅托竹蓀的邊角廢料菌托中的多糖,采用NMR分析得出,這3種多糖為既具有α構型又具有β構型的酸性多糖。

a.全圖total graph; b.局部放大圖partial enlarged detail圖3 海巴戟果實純化多糖的1H NMR(25 ℃)Fig.3 1H NMR spectra(25 ℃) of purified polysaccharide from M. citrifolia fruit

2.3 粗多糖和純化多糖的抗氧化活性

2.3.1·ABTS+清除能力 由圖4(a)可知,海巴戟果實粗多糖和純化多糖對·ABTS+都具有一定的清除能力。粗多糖質量濃度為1 g/L時,對·ABTS+的清除率達到100%,之后隨著質量濃度增加而趨于穩定。純化多糖質量濃度為0～5 g/L時,對·ABTS+清除率與純化多糖質量濃度呈正相關,在質量濃度為5 g/L時,·ABTS+的清除率達到100%。由此可知:海巴戟果實多糖具有很強的·ABTS+清除能力,低濃度時,粗多糖較純化多糖的清除能力強,且粗多糖對ABTS+的清除能力與Vc相當。

圖4 海巴戟果實多糖清除自由基的能力Fig.4 The radical scavenging ability assay of polysaccharide from M. citrifolia fruit

2.3.2DPPH·清除能力 由圖4(b)可知,海巴戟果實粗多糖和純化多糖在質量濃度為0～3 g/L時對DPPH·清除率與多糖質量濃度呈正相關,3 g/L時清除率達到最大,分別為93.50%和30.18%;隨著質量濃度繼續增加,清除率略有下降。與純化多糖相比,粗多糖具有更強的DPPH·清除能力,但略低于Vc。魯鐵等[26]研究也發現了相似的規律:多糖質量濃度在一定范圍(0.5～2.0 g/L)內,對DPPH·的清除能力與質量濃度呈量效關系;而超過該質量濃度范圍時,隨著多糖質量濃度的增加,對DPPH·的清除能力呈現下降趨勢;2.0 g/L時,白蠟多年臥孔菌子實體和菌絲體多糖對DPPH·的清除率達到最大,分別為45.67%和51.67%。純化多糖對DPPH·清除率遠低于粗多糖,主要原因可能是粗多糖中的糖醛酸和蛋白質含量較高,而糖醛酸含有豐富的羧基和羥基,能夠給DPPH·提供質子,從而清除DPPH·[27]。

2.3.3·OH清除能力 由圖4(c)可知,質量濃度為1～5 g/L時,·OH清除率與粗多糖的質量濃度呈現正相關,在5 g/L時清除率為86.71%。純化多糖在1 g/L時·OH清除率最大為45.81%,在2 g/L時迅速下降至15.36%,2～5 g/L范圍內·OH清除率基本保持不變?？梢钥闯?海巴戟果實粗多糖的·OH清除能力強于純化多糖。

2.3.5還原力 海巴戟果實粗多糖和純化多糖的還原力測定結果見圖5。由圖可知,海巴戟果實粗多糖和純化多糖均具有還原能力。在1～5 g/L范圍內,粗多糖還原力與質量濃度呈現正相關,在5 g/L時還原力最大為1.01。在1～4 g/L范圍內,純化多糖還原力與質量濃度呈現正相關,在4 g/L時還原力達到最大為0.26,隨后下降?？梢钥闯?海巴戟果實粗多糖的還原力大于純化多糖,但均低于陽性對照Vc。

圖5 海巴戟果實多糖的還原力Fig.5 Reducing power of polysaccharides from M. citrifolia fruit

3 結 論

3.1以海巴戟果實為原料,干燥、粉碎后經熱水浸提法提取得到粗多糖,提取得率為9.48%,進一步純化得到純化多糖的得率為0.35%。通過FT-IR、GC-MS和1H NMR分析表明:純化多糖主要為β-型糖苷,同時還有少量α-型糖苷;純化多糖是以1→4連接的吡喃葡萄糖和非還原末端的吡喃葡萄糖為主要連接方式的多糖,由于存在1→2,6連接的吡喃甘露糖和1→3,6連接的吡喃半乳糖,所以純化多糖存在分支結構。

3.3海巴戟粗提多糖提取工藝簡單,抗氧化能力強,具有開發為天然抗氧化劑的巨大潛力。