滸苔抑菌成分的提取工藝優化及其活性研究

張中堂, 陳天樂, 柏亞萱, 盤賽昆,2*

(1.江蘇海洋大學 海洋食品與生物工程學院,江蘇 連云港 222005; 2.江蘇海洋大學 江蘇省海洋生物技術重點實驗室;江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心,江蘇 連云港 222005)

滸苔俗稱苔條、苔菜,是一種常見的多細胞綠藻,全球有40余種,我國有11種,分別為腸滸苔、條滸苔、管滸苔、扁滸苔和緣管滸苔等[1],主要分布在我國福建、江蘇、浙江、遼寧、山東等地。滸苔繁殖能力極強,只要到達繁殖溫度,就能快速增殖,而且抗逆性很強,即使在惡劣的環境下只要滿足生長條件,就會迅速繁殖。由于滸苔能附生在其他養殖生物體上,因此常被當作一種有害生物,同時滸苔對環境也會造成很大危害[2-4]。滸苔因具有一定的食品、藥理價值,所以對于其活性成分的提取是高效利用的關鍵環節。Rizvi等[5]對巴基斯坦海岸26種海藻進行了抗菌活性篩選, 發現腸滸苔對多種真菌具有抑制活性。Hellio等[6]研究了30種海藻提取物對35種海洋附生細菌的抑制作用,結果發現腸滸苔乙醇提取物對6種革蘭氏陽性細菌具有較強的抑制活性(抑菌圈直徑5～6 mm),對另5種革蘭氏陽性細菌有一定的抑制活性(抑菌圈直徑3～4 mm)。Mehrtens[7]對北極21種大型海藻的研究發現:扁滸苔具有較高的碘代過氧化物酶活性,而該活性可能與其抗菌等化學防御作用相關。海藻中抗菌活性物質主要有脂類、酚類、萜類、多糖類、鹵化物、含硫化合物等。目前在滸苔中已經鑒定出許多活性組分。如李凌緒等[8]發現滸苔的乙醇提取物對甜椒灰霉菌、鏈格孢菌有較強的抑制作用,對立枯絲核菌、蘋果干腐菌、香蕉炭疽菌、鐮刀菌等植物病原真菌菌絲生長也有一定抑制作用,推測活性成分可能為酚類、糖類、內酯或甾醇。Shahnaz等[9]研究發現腸滸苔甲醇提取物對3種細菌和10種真菌均具有抗菌活性,并利用質譜、核磁和GC-MS技術從活性提取物中分離鑒定出β-谷甾醇、反式-植醇和多種脂肪酸物質。Sukatar等[10]發現緣管滸苔甲醇和氯仿提取物對5種革蘭氏陽性細菌、 4種革蘭氏陰性細菌和白色念珠菌的抗菌活性明顯強于正己烷和二氯甲烷提取物,并運用GC-MS鑒定了緣管滸苔中的35種揮發性成分,主要有正三十四烷(8.45%)、正十七胺(6.65%)、二十二烷(6.46%)。對滸苔中各種生物活性物質的開發研究,可為新型保健品、化妝品、食品、藥品等開發提供新的思路,從而為滸苔資源的進一步加工利用提供理論依據。因此,本研究對滸苔抑菌活性成分的提取工藝進行了優化,考察了條滸苔水提取物和乙醇提取物對金黃色葡萄球菌等的抑制作用,并通過GC-MS對抑菌物質進行成分分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

條滸苔懸液,自制[11];菌種:大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),所有菌株均為實驗室培養。

石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇、甲醇、三氯化鐵、無水乙醇、三氯化鋁、乙酸鎂、氯化鈉、硅鎢酸,均為市售分析純;硅膠板,青島海洋化工有限公司;硅膠板營養肉湯,北京陸橋股份技術有限公司;瓊脂,上海阿拉丁公司;酵母提取物、胰蛋白胨,英國OXOID公司。

DNP-9162電熱恒溫培養箱,上海精宏實驗設備有限公司;ZF-20D暗箱紫外分析儀,鞏義市予華儀器有限責任公司;GC-2010氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)儀、DB-23色譜柱,島津(上海)實驗器材有限公司。

1.2 提取方法

1.2.1水提取 將300 mL條滸苔懸液倒入平底蒸餾瓶,80 ℃水浴回流4 h,回流提取3次,合并提取液,離心、過濾,旋轉蒸發濃縮至黑色浸膏狀,4 ℃冰箱內保存備用。

1.2.2乙醇提取 按照文獻[8]方法:將10 g條滸苔粉加入平底蒸餾瓶,倒入體積分數為95%乙醇溶液300 mL,80 ℃水浴回流4 h,回流提取3次,收集并合并提取液,離心、過濾。用旋轉蒸發儀減壓回收乙醇至無醇味,得黑色浸膏狀,4 ℃冰箱內保存備用。

1.3 抑菌活性測試

1.3.1待測溶液配制 采用牛津杯法[12-13]進行抑菌試驗,所用器皿與材料滅菌備用。分別稱取2種提取方法的條滸苔浸膏1 g溶解在10 mL單蒸水中,調配成質量濃度為100 g/L的待測溶液。

1.3.2供試菌株的培養及活化 -80 ℃冰箱取出保存的菌株,無菌條件下用槍頭吸取50 μL于平板牛肉膏蛋白胨培養基中,三區劃線法將供試菌株均勻分布,放入培養箱中37 ℃培養24 h。相同方法連續培養兩代。

1.3.3菌懸液的制備 將滅菌后的生理鹽水,培養箱里取出的含菌平板放入超凈工作臺內,從中劃取一環菌株,再用生理鹽水在試管中配制成107cfu/mL的菌懸液。

1.3.4條滸苔不同提取物的抑菌圈檢測 無菌條件下將平板,瓊脂培養基放入超凈工作臺內,制作成培養基板,將指示菌的菌懸液打入培養皿板中,涂布,再將牛津杯放入已經凝固的含菌平板上,輕輕按壓,吸取100 μL待測溶液打入每個牛津杯中,每塊平板里各放3個牛津杯,然后所有待檢測菌株實驗設計3次,以95%乙醇溶液為陰性對照,然后放入生化培養箱中培養,設置培養溫度為37 ℃,培養16 h后取出,用游標卡尺測量抑菌圈大小,計算平均值。

1.4 滸苔抑菌物質的提取工藝優化

1.4.1單因素試驗 準確稱取10 g的烘干條滸苔粉,按照一定液料比(20∶1～50∶1,mL∶g,下同)加入一定體積分數(65%～95%)的乙醇溶液,在一定溫度(60～90 ℃)下恒溫水浴提取一定時間(2～5 h)。提取液5 000 r/min離心,并在旋轉蒸發儀中濃縮至無醇味黑色浸膏狀?？疾煲毫媳?、乙醇體積分數、提取溫度和提取時間對抑菌圈直徑的影響。

1.4.2響應面試驗優化 根據單因素試驗結果,發現提取時間對條滸苔提取物抑菌效果的影響并不顯著,因此固定提取時間為4 h。響應面試驗依照Box-Beheken中心原理設計實驗組合[14-15],以抑菌圈直徑為響應值,選擇提取溫度、液料比、乙醇體積分數設計3因素3水平響應面分析試驗。

1.5 滸苔中主要成分常規定性分析

1.5.1待測溶液配制 稱取0.25 g響應面優化法得到的條滸苔提取物,用95%乙醇溶液溶解至50 mL,備用。

1.5.2生物堿成分檢測 準確稱量0.5 g硅鎢酸,溶解在10 mL滅過菌的單蒸水中,調配為硅鎢酸試劑。在試管里添加2 mL樣品溶液,加入2～3滴硅鎢酸溶液,觀察是否有淺黃色或灰白色沉淀。

1.5.3蒽醌及其苷類檢測 取樣品溶液5 mL于試管內,滴加少量1%乙酸鎂甲醇溶液,觀察其顏色是否呈現紅色反應。

1.5.4酚類成分的檢測 取樣品溶液5 mL于試管內,加入2 mL 1%的三氯化鐵乙醇溶液,觀察其顏色是否呈綠色、暗紫色或生成沉淀。

1.5.5黃酮及其苷類檢測 取5 mL樣品溶液于試管內,加入2 mL 1%三氯化鋁乙醇溶液,觀察其顏色是否變為亮黃色。

1.5.6有機酸檢測 取樣品溶液滴在pH試紙上,觀察試紙顏色是否低于pH值7。

1.5.7甾醇、萜類檢測 取樣品溶液5 mL于試管內,加入5 mL氯仿,再沿試管壁小心緩慢加入濃硫酸,觀察氯仿層是否呈紅色反應。

1.5.8皂苷成分檢測 取適量樣品溶液于試管中,蓋上橡膠塞子,握住試管用力振搖1 min,如有大量蜂窩狀氣泡產生,靜置一段時間后,氣泡沒有消失,說明含有皂苷成分。

1.6 不同溶劑萃取物的制備及抑菌實驗

1.6.1萃取物的制備 將最佳工藝條件下得到的10 g條滸苔提取物溶解于100 mL去離子水中,移入1 000 mL分液漏斗內,加入300 mL石油醚,搖晃混勻并分層后,排出石油醚萃取液。用上述萃取方法將留下的水溶液重復萃取2次,3次石油醚萃取液合并后,用旋轉蒸發儀減壓回收石油醚,得到石油醚萃取物。萃取后留下的水溶液依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取3次,并減壓濃縮后,得到二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水溶物。

1.6.2抑菌實驗 各萃取物旋干溶劑后用乙醇配制成10 g/L的樣品溶液,以金黃色葡萄球菌為供試菌,用牛津杯法進行抑菌實驗。

1.7 乙酸乙酯萃取物的GC-MS分析

DB-23毛細管柱,初始溫度50 ℃,保持4 min,以4 ℃/min升至230 ℃,保持5 min;載氣為氦氣,載氣流量為10 mL/min,進樣口溫度250 ℃;進樣量1 μL;分流比50∶1。轟擊電壓70 eV,質譜掃描范圍40～550 u;離子源溫度200 ℃;GC-MS接口溫度250 ℃;標準質譜圖檢索庫NIST。

2 結果與討論

2.1 不同溶劑提取物的抑菌效果比較

不同溶劑提取物的抑菌效果見表1。由表可知,條滸苔的水提取物和乙醇提取物對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌無抑制作用;水提取物對金黃色葡萄球菌也無抑制作用,而乙醇提取物對金黃色葡萄球菌具有抑制效果,抑菌圈直徑達到1.06 cm。因此,后續優化工藝過程中考察對金黃色葡萄球菌的抑菌效果。

表1 不同條滸苔提取物的抑菌效果Table 1 The antibacterial effect of different extracts from E. clathrata

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1液料比 在提取時間4 h、提取溫度80 ℃和乙醇體積分數95%條件下,液料比對條滸苔提取物抑菌效果的影響結果見圖1(a)。由圖可知,抑菌圈的大小會因為液料比的不同而出現波動,液料比由20∶1增加到30∶1時,抑菌圈直徑逐漸增大,并在30∶1時抑菌圈直徑最大,之后隨著液料比的繼續增大,抑菌圈直徑逐漸減小。因此,液料比30∶1時抑菌效果最佳。

a.液料比值liquid-solid ratio; b.提取時間extraction time; c.提取溫度extraction temp.; d.乙醇體積分數ethanol volume fraction圖1 不同條件對條滸苔提取物抑菌效果的影響Fig.1 Effect of different conditions on antibacterial effect of enteromorpha extract

2.2.2提取時間 在液料比30∶1、提取溫度80 ℃和乙醇體積分數95%條件下,提取時間對條滸苔提取物抑菌效果的影響結果見圖1(b)。由圖可知,抑菌圈的大小也會因為提取時間的不同而出現變化,2～4 h時抑菌圈大小會呈現出緩慢增大的趨勢,這是因為滸苔含有的抑菌活性成分因提取時間的延長而被溶出,且抑菌圈直徑在提取時間為4 h時達到最大。4 h以后,提取時間繼續延長,抑菌圈直徑略有減小,這是因為提取時間一直延長,提取出來的抑菌活性成分結構極有可能被破壞。因此,提取時間選擇4 h為宜。

2.2.3提取溫度 在液料比30∶1、提取時間4 h和乙醇體積分數95%條件下,提取溫度對條滸苔提取物抑菌效果的影響結果見圖1(c)。由圖可知,抑菌圈的大小還會因為提取溫度的不同而出現變化,在60 ℃時,可能因為溫度不夠高,達不到提取大量有效抑菌物質的要求,所以抑菌作用較弱;而在70 ℃時抑菌作用略有提升,可能是溫度的提高使一些具有抑菌作用的成分被溶出;隨著溫度繼續升高,到達80 ℃時,可能由于到達了抑菌活性成分溶出點,對金黃色葡萄球菌抑菌作用最強。當溫度繼續升高時,抑菌效果反而減小,這可能是由于溫度太高,使具有抑菌作用的活性成分遭到破壞。因此,選擇80 ℃作為條滸苔最佳提取溫度。

2.2.4乙醇體積分數 在液料比30∶1、提取溫度80 ℃和提取時間4 h條件下,乙醇體積分數對條滸苔提取物抑菌效果的影響結果見圖1(d)。由圖可知,當乙醇體積分數為65%和75%時沒有抑菌圈出現,不具有抑菌作用,這可能是因為乙醇體積分數尚未達到提取其抑菌物質的效果。當乙醇體積分數為85%時出現抑菌作用,可能是隨著乙醇體積分數的升高,達到了破壞條滸苔結構的效果,使具有抑菌作用的物質被提取出來。繼續增大乙醇體積分數到95%時,抑菌效果更好,可能是越來越多的抑菌活性成分因為乙醇體積分數的升高而被溶解出來。因此,選擇體積分數為95%乙醇作為提取溶劑。

綜上所述,選擇液料比30∶1、提取時間4 h、提取溫度80 ℃和乙醇體積分數95%時提取效果較佳。

2.3 響應面試驗結果分析

2.3.1響應面試驗設計及結果 選擇液料比(X1)、提取溫度(X2)、乙醇體積分數(X3)為自變量,抑菌圈直徑(Y)為響應值,根據Box-Beheken模型,通過選用響應面8.0.6軟件設計,得到響應面試驗設計及結果見表2。

表2 Box-Beheken試驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Beheken experiment

2.3.2方差分析 對回歸模型進行方差分析,結果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

2.3.3最優提取工藝的確定和驗證實驗 通過響應面軟件分析,獲得最優工藝參數為:液料比28.25∶1、提取溫度83.52 ℃、乙醇體積分數91.53%,此條件下滸苔提取物對金黃色葡萄球菌最大抑菌圈直徑預測值為1.164 cm。為操作方便選擇液料比為30∶1、提取溫度為83 ℃、乙醇體積分數為92%。在最優提取工藝條件下做3次驗證實驗,得到金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為(1.152±0.015)cm,與模型預測值基本一致。因此,此實驗設計的優化模型參數,能為滸苔抗菌活性成分的提取進行較好的優化。

2.4 滸苔抗菌物質常規定性分析

對生物堿成分、蒽醌及其苷類、酚類成分、黃酮及其苷類、有機酸、甾醇及萜類、皂苷成分進行檢測,結果發現:生物堿、蒽醌及其苷類、酚類、黃酮及其苷類檢測均未產生沉淀或相應的顏色反應,表明條滸苔乙醇提取物中不存在上述成分;有機酸檢測發現pH試紙呈現橙黃色,表明提取物中含有有機酸物質;甾醇及萜類檢測發現氯仿層有紅色反應,表明提取物中含甾醇及萜類物質;皂苷檢測發現用力振搖后無氣泡產生,表明提取物中無皂苷成分。

2.5 不同溶劑萃取物的抑菌效果

從表4可以看出,石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物都具有抑菌活性成分,對金黃色葡萄球菌都有良好的抑制作用,其中乙酸乙酯萃取物的抑菌效果最好,其次是二氯甲烷萃取物,最后是石油醚萃取物,而正丁醇萃取物和水萃取物對金黃色葡萄球菌基本沒有抑制作用。說明滸苔中的大多數抑菌活性成分都集中在乙酸乙酯萃取物中,主要以中等和弱極性的物質為主。

表4 不同溶劑萃取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果Table 4 Antibacterial effect of different solvent extracts on S. aureus

2.6 乙酸乙酯萃取物的GC-MS分析

圖2 乙酸乙酯萃取物的GC-MS總離子流Fig.2 Ethyl acetate extract GC-MS total ion chromatogram

3 結 論

3.1通過對條滸苔水提取物和乙醇提取物的抑菌活性研究發現:與水提取物相比,條滸苔乙醇提取物的抑菌效果更好,對金黃色葡萄球菌有較好的抑制效果,而對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌沒有抑菌作用。

3.2通過單因素試驗和響應面分析法優化乙醇提取滸苔抑菌活性物質的提取工藝,得到最佳提取工藝條件為:乙醇體積分數92%、液料比30∶1、提取溫度83 ℃、提取時間4 h。此條件下,乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為(1.152±0.015) cm。

3.3采用定性化學分析方法對條滸苔乙醇提取物中的抑菌成分進行檢測,結果表明:條滸苔乙醇提取物中含有有機酸類、甾醇及萜類等成分,不含生物堿、蒽醌、酚類、皂苷、黃酮類等成分。不同溶劑萃取物對金黃色葡萄球菌的抑菌實驗結果表明:乙酸乙酯萃取物的抑菌效果最好,二氯甲烷和石油醚萃取物次之,正丁醇和水萃取物沒有抑菌效果。通過GC-MS對乙酸乙酯萃取物進行分析,發現乙酸乙酯萃取物中含有12種揮發性成分,主要為酸類、芳香類化合物。