砷在不同物候期香蒲中的分布及其生理影響

羅維綱,張晉龍,劉云根,3

1.西南林業大學生態與環境學院,云南 昆明 650224 2.中國科學院地理科學與資源研究所,北京 100101 3.云南省山地農村生態環境演變與污染治理重點實驗室,云南 昆明 650224

湖濱帶作為湖泊與陸地之間的過渡地帶,承擔著攔截陸源污染、降解污染物、改善水質和維護生物多樣性等多重生態作用,是維護湖泊水環境安全的關鍵環節[1]。目前,湖濱濕地存在一定程度的重金屬污染問題,由于重金屬具有難降解性和生物富集性,對動物與植物造成了較大的生態傷害[2]。重金屬污染不僅會影響水環境安全,還會隨著食物鏈將危害傳遞給人類[3],影響人類健康。已有的研究表明,許多濕地都受到一定程度的重金屬污染[4-6]。As是一種具有致癌性和毒性的重金屬元素,其對植物的光合作用、葉綠素的生物合成及抗氧化酶系統均有一定干擾,當它的濃度積累到一定程度的時候,會對植物正常的生理代謝功能產生較大影響,從而對植物生長產生抑制作用,甚至會導致植物枯萎[7-9]。

挺水植物是湖泊生態系統中最主要的生物群落之一,已被廣泛用于湖濱水體重金屬污染治理中。它在吸收外來污染、攔截流域沉積物、優化底泥環境和微生物群落建設中具有重要意義[4]。香蒲是中國最具代表性的湖濱濕地水生植物之一,具有生物量大、覆蓋率高、能耐高濃度重金屬污染等特點,同時對生活和工業廢水中的氮、磷和有機物有較強吸附富集能力,已被大量引入中國的濕地生態修復建群種中[10-11]。在評價植物對重金屬的吸收效能時,系統考察植物各生長階段內重金屬含量變化情況,確認植物最佳收獲時間,對于植物修復重金屬污染非常必要。目前As污染對陸地植物、農作物、藻類[12-13]等的影響機制研究已取得一定進展,但對生長在湖濱濕地的相關植物研究較少。因此,該研究將香蒲作為研究對象,采用水培模擬實驗,研究其對水環境中重金屬As污染的修復過程。利用差速離心技術對香蒲葉組織亞細胞成分進行分離,對As在香蒲葉內亞細胞水平的分布特征及香蒲對As產生的生理響應進行研究,擬揭示香蒲對As的耐性和解毒機理,以期為重金屬在植物細胞中的分子機理研究提供參考。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

香蒲購自昆明市泛亞育苗基地(均在無As條件下生長),花盆(上口徑為19 cm、下口徑為13 cm、高為23 cm),定植籃(直徑為20 cm,高為6 cm,底徑為13.5 cm),鵝卵石購自石材加工廠。培養液以改進的Hoagland配方為基礎,As以Na2HAsO4·7H2O形式添加。

1.2 實驗設計

采用水培模擬實驗,選擇生物量與高度彼此接近的植株,將其種植在花盆里,把定植籃和鵝卵石放在花盆上方,以便固定植株。將植株放在改進的Hoagland營養液中預培養15 d,再置于濃度為0、0.5、2.0、5.0、10.0 mg/L的As處理液(分析純)中。每次處理都設定3個平行實驗,每個平行實驗都有3株植物,一共獲得45份樣品。用去離子水維持溶液體積,每周更換一次培養液。在滇中高原,香蒲幼苗期為4月上旬—6月上旬,花果期為6月下旬—9月下旬,枯黃期為10月上旬—12月上旬。該實驗擬在生長期(7月7日)、花果期(9月7日)和枯黃期(11月7日)采集并檢測香蒲的對應指標。

1.3 測定指標及方法

將采集的香蒲葉直接用去離子水沖洗,再用吸水紙吸取葉片上的水分。將處理后的新鮮植物樣本剪成小塊,稱取1 g樣品,用15 mL硝酸隔夜浸泡,使用濕法消解(硝酸與高氯酸的體積比為3∶1,試劑均為分析純),將樣本消解到澄清狀態,并用去離子水過濾,定容到50 mL。采用雙通道原子熒光光度計(北京吉天儀器有限公司)測量As含量,并通過以下方程來計算香蒲葉細胞組織中As的富集系數。

富集系數(BCF)=香蒲葉細胞組織內

As含量/營養液中As濃度

1.3.2 香蒲亞細胞組分的分離及As的測定

參考WANG等[14]的方法進行亞細胞組分分離,將1 g鮮樣按照料液比為1∶10進行稱量,將10 mL提取液、250 mmol/L蔗糖、50 mmol/L Tris-HCL (pH為7.4)、1 mmol/L二硫赤蘚糖醇(C4H10O2S2)于4 ℃進行研磨以使漿料均勻。將300 g勻漿液離心2 min,得到的沉淀物是沒有破裂的殘余物與細胞壁;用2 000 g上清液離心15 min,得到的是含有細胞核與葉綠體組分的沉淀物;用10 000 g上清液離心20 min,得到的是含有線粒體組分的沉淀物以及上清液中的可溶性組分(包括細胞漿、細胞液、核糖、蛋白質等)。各工序的勻漿都在4 ℃左右條件下參與實驗。用15 mL硝酸隔夜浸泡全部樣品,以濕法消解(硝酸與高氯酸的體積比為3∶1,試劑均為分析純),使樣品變得澄清,并以去離子水過濾,定容至50 mL。采用雙通道原子熒光光度計(AFC-810,北京吉天儀器有限公司)測定As含量,進一步計算As在香蒲亞細胞組織中的富集系數,計算公式如下。

富集系數(BCF)=香蒲亞細胞組織內

As含量/營養液中As濃度

1.3.3 抗氧化酶活性及丙二醛含量的測定

不同抗氧化酶及丙二醛含量的測定方法見表1。

表1 不同抗氧化酶及丙二醛含量的測定方法Table 1 Methods for determination of different antioxidant enzymes and malondialdehyde content

1.4 數據分析

使用 Excel 2018對原始數據進行整合與處理,利用SPSS 21.0對數據進行差異性分析(P<0.05為顯著性差異水平,P<0.01為極顯著差異水平),利用Origin 2021繪制圖表。

2 結果

2.1 不同濃度As脅迫下不同物候期香蒲葉內As的累積特征

As脅迫下香蒲葉不同物候期的As含量及富集系數見圖1。

取小鼠部分子宮組織，經研磨、裂解、勻漿、離心，取上清液，進行BCA蛋白定量，SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜。浸于5% BSA封閉，分別用MMP-9、TLR4及NF-κB一抗低溫過夜孵育（1∶2 000，4 ℃）。次日漂洗后更換二抗孵育30 min（1∶5 000，常溫），漂洗后ECL化學發光、顯影。ImageQuant軟件掃描并分析相應灰度值，檢測需重復3次。

圖1 As脅迫下香蒲葉不同物候期As含量及富集系數Fig.1 As content and enrichment coefficient of Typha angustifolius L. leaves at different phenological stages under As stress

從圖1(a) 可以看出,在As濃度為0、0.5、2.0、5.0、10.0 mg/L脅迫下,香蒲葉不同物候期As含量總體呈增長趨勢。隨著脅迫濃度的增加,香蒲葉中As含量逐漸增加;隨著脅迫時間的延長,香蒲葉中的As含量呈下降趨勢,生長期香蒲葉內的As含量最高,表明香蒲在生長期對As的積累能力最強;當As濃度提高時,香蒲葉片中As的含量明顯高于對照組(P<0.05)。當As脅迫濃度達到2.0 mg/L以上時,香蒲葉中As含量增長速度明顯增加,說明高濃度As脅迫環境對香蒲去除As有促進作用。

在生長期、花果期、枯黃期中,As脅迫使香蒲葉片As含量為對照組的1.47～7.65、2.64～12.72、1.55～5.57倍,隨著脅迫時間的延長,生長量呈遞減趨勢。在同一外源As脅迫條件下,香蒲葉中As的濃度隨香蒲的生長而降低,在枯黃期,As濃度僅為生長期的49.13%～67.47%。

As脅迫生境下,香蒲對As的富集系數(BCF)如圖1(b)所示。生長期、花果期、枯黃期,香蒲葉對營養液中As的BCF數值變化范圍分別為0.64～2.44、0.50～2.06、0.31～1.74;隨著As濃度的增加,各時期香蒲葉BCF均呈逐漸減小的趨勢,As濃度為10.0 mg/L時,各時期的BCF均達到最小值。

根據BCF范圍可以看出,香蒲葉對As的富集吸收能力水平一般。

2.2 同濃度As脅迫下不同物候期香蒲亞細胞組分變化情況

2.0 mg/L的As脅迫下不同物候期香蒲亞細胞各組分的As含量及占比見圖2和圖3。

圖2 2.0 mg/L As脅迫下不同物候期香蒲亞細胞各組分As含量Fig.2 As content of subcellular components of Typha angustifolius L. under 2.0 mg/L As stress at different phenological stages

圖3 2.0 mg/L As脅迫下不同物候期香蒲亞細胞各組分As含量占比Fig.3 The percentage of As content in each component of Typha angustifolius L. subcellular at different phenological stages under 2.0 mg/L As stress

由圖2可知,在2 mg/L As濃度脅迫下,As在不同物候期香蒲葉各亞細胞組分中的含量分布均表現為細胞壁和細胞液>細胞核和線粒體。在不同物候期,細胞壁和細胞液As含量之和為細胞核和線粒體的1.75～5.55倍,雖然各時期有所差異,但差異不明顯;不同生長階段,線粒體中As累積含量差異顯著,具體表現為生長期最高,花果期最低,生長期線粒體中As累積含量為花果期的7.2倍。由圖3可知,隨著香蒲的生長,As在葉細胞壁與細胞液的分布占比總和達到63.5%～84.5%,說明細胞壁及細胞液是香蒲葉內As的重要儲庫。

2.3 As脅迫對香蒲酶活性及MDA含量的影響

As脅迫下香蒲葉酶活性及MDA含量變化情況見圖4。

圖4 As脅迫下香蒲葉酶活性及MDA含量變化Fig.4 Changes of enzyme activity and MDA content in Typha angustifolius L. leaves under As stress

由圖4可知,As脅迫下,過氧化物酶(POD)生長期活性隨As濃度的增加呈上升的趨勢,除As濃度為0.5 mg/L外,其余的As濃度下,POD活性均明顯高于對照組。當As濃度為10.0 mg/L時,POD活性為13.36 μ/mgFW,為對照組的1.92倍;花果期POD活性增長幅度與生長期對比相對較低,枯黃期POD活性與對照組持平?；ü诤涂蔹S期,超氧化物歧化酶(SOD)活性均比對照組顯著增加,在As濃度為5.0 mg/L 時,花果期SOD活性為145.05 μ/mgFW,為對照組的1.82倍,但生長期SOD活性與對照組相比,變化幅度不大。生長期和花果期,過氧化氫酶(CAT)活性均呈先上升后下降的趨勢,枯黃期CAT活性總體呈下降趨勢?；ü诤涂蔹S期不同濃度As脅迫下,丙二醛(MDA)含量均顯著增加,生長期MDA含量呈先下降后上升的趨勢,不同時期MDA含量在10.0 mg/L As脅迫時均達到最大值,分別為對照組的1.26、1.93、3.14倍。As對不同物候期香蒲葉中POD活性的影響與As濃度呈正相關,對CAT活性具有低促高抑的效果,且在不同的物候期,POD與CAT之間呈現互補性,隨著 As含量的提高和香蒲的生長,SOD和MDA的含量明顯升高。

3 討論

3.1 As在香蒲葉內的累積特征

基于植株生物量、代謝能力及根系活力等多方面因素的影響,不同物候期的植物對生長環境中的重金屬表現出不同的積累特征[16]。該研究結果顯示,生長期香蒲葉內的As含量一直都最高,表明生長期的香蒲對As的積累能力最強。這可能是由于在香蒲生長初期,污染生境中各元素相對充足,植物根系會快速吸收環境中的礦物元素[17],體內積累速度較快,導致地下部As更多地被轉移至地上。從圖1可以看出,花果期和枯黃期香蒲體內As的積累量明顯下降,可能是由于生長后期植株個體生命衰退,皮層組織老化,對As的積累能力下降[18]。

As對植物的影響在很大程度上取決于脅迫濃度和脅迫周期[19]。As含量和它的富集系數是衡量植株富集金屬能力的一個重要指標[20]。研究顯示,在生長期、花果期和枯黃期,As的脅迫濃度≤10.0 mg/L時,香蒲的BCF值分別為0.64～2.44、0.50～2.06、0.31～1.74,2.0 mg/L是As脅迫濃度的分界點(圖1),當As的脅迫濃度大于2.0 mg/L時,BCF值小于1.0,說明香蒲葉對As的富集作用不大。

這可能是由于As(Ⅴ)是通過PHT被吸收的[21],而As(Ⅲ)通過水通道蛋白進入植物體內[22],損害蛋白質,改變根系的生理特征,抑制As向地上部轉移,從而使其在根中積累更多。在非超富集As植物中,As主要累積在植物根系部分,張晉龍等[23]研究也發現,在所有的As脅迫濃度下,香蒲根的As質量分數均較大,是葉的10.04～25.08倍,說明香蒲葉對As的富集能力不如根系部分。

3.2 As在香蒲亞細胞組分的分布特征

As在香蒲不同亞細胞組分中的選擇性分布存在著明顯的差別,其分布特征揭示了植物對重金屬的解讀機制[24-25]。孫宇等[26]通過對水稻的研究發現,As的分布部位以細胞液為主;ZVOBGO[27]研究表明,As在煙草細胞中的分布部位以細胞壁為主;TURNER等[28]觀察到,根癌農桿菌耐高濃度Zn的能力似乎和Zn與細胞壁結合的程度呈正相關。據NISHIZONO等[29]報道,山羊草中70%的Cu、Zn和Cd元素儲存在根的細胞壁中,其中大部分以離子形式存在,或與纖維素、木素等結構性物質結合[30]。BOOMINATHAN等[31]對超富集植物和非超富集植物的纖維細胞中重金屬分布的研究表明,大部分重金屬在纖維細胞內是從細胞壁中被分離出來的。筆者研究結果顯示,As在香蒲葉細胞壁和細胞液內比例分別為29.2%～41.3%、34.3%～43.2%,表明細胞壁和細胞液是香蒲中As的主要儲存部位,BORA等[32]提到,因為在大型水生植物的細胞壁中包含較多的陰離子多糖(如半乳糖酸)等親金屬離子配位基團,能夠與重金屬離子發生高效的結合作用,進而增加細胞壁上的重金屬濃度,這與筆者研究結果一致。同時,WU等[33]采用差速離心法及同步輻射 X射線熒光光譜學技術,發現小白菜細胞液中鉛的富集量僅次于細胞壁,也與筆者研究結果相符合。

3.3 As對香蒲抗氧化性和MDA含量的影響

CAT是一種重要的抗氧化蛋白,其最大成分在細胞的過氧化物體內,作用是將過量的H2O2清除到細胞外[34],以保持細胞內H2O2的平衡,并保護細胞膜[35]。該研究表明,在受到的As脅迫大于等于2.0 mg/L時,不同物候期香蒲葉的CAT活性均有所下降,尤其是生長期和花果期較為明顯,CAT下降,細胞膜通透性增加,對As的富集吸收量也增加。

SOD是一種具有清除超氧自由基功能的酶,適度逆境條件可增強其活力,提高植物對脅迫的抗逆能力[36]。研究顯示,香蒲葉經As脅迫后,抗氧化性隨As脅迫強度而增強,當As的脅迫濃度為10.0 mg/L時,抗氧化性有所下降,這可能是由于該濃度超過了植物機體承載能力,抗氧化性隨之降低。

POD活性變化非常明顯,當As的脅迫濃度為2.0 mg/L時,POD活性迅速增加,當As的脅迫濃度為10.0 mg/L時,POD依然能保持很高的活性。與前2種酶相比,POD具有很強的抗氧化功能,這一結論與王友保等[37]所做的有關小麥的實驗結果有相似之處。POD是一種普遍存在于植物中的具有催化降解毒性化合物作用的氧化還原酶,在環境受到污染時,同工酶水平將發生顯著變化。POD活性的提高,是因為As在進入植物體后,植物體會產生對自身不利的過氧化物,POD使用H2O2對這些過氧化物進行氧化分解,因而,在植株中,隨著過氧化物酶底物含量的提高,POD活性也隨之提高[38]。

MDA是膜脂過氧化產物中的一種,反映了細胞內脂質過氧化反應的水平以及膜系統的損傷程度。該研究結果顯示,隨香蒲的生長衰老以及As脅迫的增加,MDA含量顯著增加,但在生長期,MDA呈先減后增的趨勢。當As的脅迫濃度為2.0 mg/L時,MDA含量最低,這是由于植物在正常條件下,活性氧的生成與去除是均衡的,對植物造成的傷害很小,但植物在脅迫條件下會以多種方式產生活性氧,而且植物對活性氧的清除能力下降,導致活性氧大量累積,對植物產生嚴重的傷害[39]。該研究表明,當As的脅迫濃度大于等于2.0 mg/L后,生長期香蒲葉的氧自由基產生速率逐漸增加,隨著時間的延長,香蒲受到的傷害增大,細胞膜的抗氧化性下降。

4 結論

1)在As脅迫下,不同物候期香蒲葉中As含量總體呈增長趨勢,且與脅迫濃度呈正相關,隨著As濃度的增加,香蒲葉中的As含量較對照組增加顯著(P<0.05);不同物候期,香蒲葉對As的吸收能力表現為生長期>花果期>枯黃期,并由富集水平可以看出,香蒲葉對As的富集能力一般。

2)在同一濃度的As脅迫下,不同物候期香蒲葉內各細胞組分的As含量有所差異,但差異不明顯。結果表明,細胞壁和細胞液內As含量分布比例之和為63.5%～84.5%,是香蒲葉中主要的儲As部位。

3)As對不同物候期香蒲葉中POD活性的影響與As濃度呈正相關,對CAT活性產生低促高抑的作用。在不同物候期,POD和CAT存在互補關系,表明抗氧化酶相互協作是香蒲應對As脅迫的重要策略,SOD和MDA含量隨香蒲生長和As濃度增加均顯著增加,表明香蒲通過限制As細胞壁的固持和細胞液的區隔化來降低As的毒害。