在線固相萃取-液相色譜法同時測定米粉中4種維生素E的含量

馬紅玉,翟洪穩,張明星,任曉偉,王 敬,黃建輝

(河北省食品安全重點實驗室,國家市場監管重點實驗室(特殊食品監管技術),特殊食品安全與健康河北省工程研究中心,河北省食品檢驗研究院,河北 石家莊 050227)

0 引言

米粉是一種以大米為主要原料的嬰幼兒谷物輔助食品,為適于嬰幼兒的各種營養需要,需要添加適量的營養強化劑。因其受眾人群是嬰幼兒,所以保證其質量與安全是監督監管的重點[1]。針對嬰幼兒谷類輔助食品,國內外都發表了相關研究以及標準[2-5]。我國在2010年發布了 GB 10769—2010《食品安全國家標準嬰幼兒谷類輔助食品》,規定了米粉中各類營養成分、含量指標以及具體檢驗方法[6]。維生素E 是其中可選擇的營養成分之一。維生素E又叫生育酚,是一類具有生物活性的酚類物質,包含α、β、γ和δ-維生素E 4種同分異構體,是機體所必需的脂溶性維生素之一[7,8]。維生素E具有抗氧化、抗不育、調節免疫力等作用[9-10]。維生素E雖是必需營養素,但嬰幼兒食物來源單一,添加量會直接影響其健康。自1922年發現維生素E以來,科學家們對其進行了大量研究,其中對α-維生素E研究居多。然而其它三種維生素E具有獨特的生物學特性,對人體健康有益,因此開發建立其分析分離方法很有必要。

維生素E性質不穩定,一般不直接加入到米粉中,在需要營養元素強化時,一般加入維生素E 醋酸酯或者維生素E棕櫚酸酯[11]。目前,米粉中維生素E的檢測方法主要采用反相色譜法[11-14],液質聯用法[15]。米粉基質中含有淀粉,在測定維生素E時,需酶解,高溫皂化,液液萃取,最后旋轉蒸發等操作將維生素E溶解于甲醇溶液中,才能使用反向色譜法進行定性定量分析[16]。該方法采用液液萃取,前處理過程繁雜,容易造成目標物的降解和損失,影響結果準確性。因此,提高前處理提取凈化效率,對于維生素E的準確測定尤為重要。除了開發新的準確高效樣品制備方法外,還有一種提高分析效率和準確性的方法,即將樣品制備技術與后續的檢測技術在線耦合。與離線樣品制備過程相比,在線凈化方法利用固相萃取取代液液萃取,不僅降低實驗試劑的消耗,而且提高了檢測準確性。近年來,在線凈化技術不斷發展,在食品檢測領域應用廣泛[17,18]。

本文建立在線固相萃取-液相色譜法測定米粉中維生素E的新方法[19]。米粉樣品經酶解、皂化處理后,直接經在線固相萃取柱凈化,然后經過六通閥進入液相色譜儀進行分析測定。整個過程簡單,省去了液液萃取、旋轉蒸發以及甲醇復溶等步驟,操作簡單便捷,避免了繁瑣操作造成的實驗誤差,且縮短了檢測時間,提高了檢測效率,減少了有機溶劑的使用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標準品:α-維生素E(SUPELCO公司)、β-維生素E(SUPELCO公司)、δ-維生素E(SUPELCO公司)、γ-維生素E(SUPELCO公司)。

α-淀粉酶(10萬U/g)、L-抗壞血酸(分析純);氫氧化鉀(KOH)(分析純)、2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)(分析純);甲醇(色譜純)、無水乙醇(色譜純)、甲基叔丁基醚(色譜純)、乙腈(色譜純)。

1.2 儀器與設備

HPLC系統(1260Aglient,配有紫外檢測器、兩個四元泵);紫外可見分光光度計(UV-2600,Shimadzu);電子天平(美國梅特勒托利多公司);離心機(德國SIGMA公司);Milli-Q純水(德國Merck公司);渦旋混勻器(德國海道夫公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準品配制

α、β、γ、δ-維生素E標準儲備液(1.0 mg/mL)臨用前進行校正(參照GB 5009.82—2016附錄B)。取上述校準后標準溶液適量,用50%乙醇水溶液(V/V)稀釋成濃度分別為1 μg/mL,2 μg/mL,5 μg/mL,10 μg/mL,20 μg/mL,50 μg/mL系列標準混合工作溶液。

1.3.2 樣品前處理

稱取5 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL離心管中,加入10 mL溫水(40 ℃),1 g淀粉酶,混合均勻置于60 ℃恒溫水浴避光振蕩30 min,振蕩搖勻,加入1.0 g抗壞血酸和0.1 g BHT,再加入20 mL無水乙醇和10 mL 50% KOH水溶液(V/V),渦旋振蕩1 min,皂化30 min(80 ℃水浴),過程中不斷振搖。皂化后冷卻至室溫,用50%乙醇水溶液(V/V)定容至50 mL,離心10 min。上層清液過濾膜后,待測。

1.3.3 色譜條件

在線固相萃取柱:PLRP-S(4.6 mm×12.5 mm,15～20 μm)。色譜柱:Poroshell 120 PFP (4.6 mm×100 mm, 4.0 μm)。進樣量:100 μL。流動相梯度洗脫見表1。

表1 在線固相萃取-液相色譜梯度洗脫程序

2 結果與分析

2.1 在線固相萃取條件的優化

目前,維生素E的提取凈化依賴于液液萃取,本研究嘗試利用固相萃取代替液液萃取過程。固相萃取是通過固體吸附劑選擇性吸附和洗脫來實現目標樣品的富集和純化,在實際操作過程中,一般包括平衡、上樣、洗脫轉移、再平衡幾個步驟。在線固相萃取模塊主要為液相泵結合六通閥,利用儀器軟件設置不同的溶劑比例以及切換時間,實現維生素E的在線提取凈化。

樣品經過酶解、皂化過程后,經過在線固相萃取柱凈化,選擇固相萃取柱時,需要選擇對強堿性溶液耐受力好的填料。選取PLRP-S柱和C18柱進行在線固相萃取,并對比其凈化效果。如圖1所示,C18柱凈化效果較差,尤其是對于α-維生素E回收率較低。PLRP-S柱為聚合物填料,化學性質穩定,對維生素E提取凈化效果良好(圖2),所以本方法選用PLRP-S柱作為在線固相萃取柱。

圖1 C18柱在線固相萃取4種維生素E色譜圖

圖2 PLRP-S柱在線固相萃取4種維生素E標準品的色譜圖(Poroshell 120PFP色譜分離柱)

在線固相萃取過程中對平衡、上樣、淋洗步驟的溶劑比例進行優化。平衡過程比較了60%甲醇水、80%甲醇水、60%乙腈水、80%乙腈水(V/V)4種溶劑,結果顯示80%甲醇水對固相萃取柱的活化再生效果較好,最終選擇其作為平衡溶劑。分別用30%乙腈水、60%乙腈水、90%乙腈水(V/V)將樣品引入固相萃取柱,當選擇90%乙腈水作為上樣溶劑時,固相萃取柱對4種維生素E具有較好的富集作用。甲基叔丁基醚和乙腈具有良好的溶解性,能除去固相萃取柱上樣品皂化液中殘留的無機鹽、蛋白質、脂肪酸和其他非皂化物等雜質,因此選用50%乙腈/甲基叔丁基醚(V/V)對固相萃取柱進行淋洗。綜上,選取PLRP-S柱作為在線固相萃取柱,80%甲醇水(V/V)平衡,90%乙腈水上樣,50%乙腈/甲基叔丁基醚(V/V)淋洗,然后進入色譜柱分析。

2.2 色譜分析條件的優化

α,β, γ, δ-維生素E 是同分異構體,其結構性質相近,色譜分離難度較大,尤其是β-維生素E和γ-維生素E只有乙酰醇環上的一個甲基位置不同[20]。以往的文獻中,大多通過正向色譜實現4種維生素E的基線分離[21],但反相色譜應用范圍更廣,與樣品溶液相容性好,使用的有害溶劑較少,并且色譜柱的穩定性和耐受度更強[22]。本文用五氟苯基硅烷鍵柱(PFP)用于4種維生素E的分離,成功地將β-維生素E和γ-維生素E分離開。此外,也對比了其他兩種色譜柱C8、C18的分離效果,均不能實現β-維生素E和γ-維生素E基線(圖3),因此選用Poroshell 120 PFP柱作為色譜分離柱。

圖3 色譜柱C8、C18分離4種維生素E色譜圖

建立液相色譜條件時,需要考慮流動相兼容性。本文分別采用甲醇-水和乙腈-水作為流動相分離4種維生素E,優化梯度分離條件。結果表明,乙腈不能使β-維生素E和γ-維生素完全分離(圖4),最終選擇甲醇作為洗脫溶劑。對甲醇-水梯度洗脫進一步優化,發現甲醇濃度達到100%(V/V)時,分離效果良好,梯度洗脫條件見表1。

圖4 乙腈-水分離4種維生素E效果圖

2.3 線性范圍與定量限

對上述優化條件進行方法學考察。結果見表2, 4種維生素E線性關系良好,R2均大于0.995。將混合標準溶液加入空白基質中,經前處理后以S/N=10計算各組分的定量限,得出4種維生素E的定量限均為50 μg/100 g,與 GB 5009.82—2016(定量限為120 μg/100g)相比較低。

表2 線性范圍、校準曲線及定量限

2.4 回收率與精密度

以大米粉作為空白樣品,加入4種維生素E的標準溶液,每個濃度重復做6個樣品。按1.3.2皂化后,利用在線固相萃取-液相色譜法測定方法的回收率和精密度,結果見表3。由表3可知,4種維生素E的加標回收率為91.2%～102.0%,相對標準偏差為1.69%～4.58%,所建方法各項性能參數滿足檢測需求。

表3 4種維生素E的加標回收率和精密度

2.5 實際樣品測定

為進一步驗證本方法對米粉中維生素E檢測的適用性,選擇在售的6種實際樣品,每個樣品做兩個平行樣品,利用在線固相萃取-液相色譜法測定其維生素E含量,結果顯示其平行性和重復性良好。表4將測定結果與樣品標示值進行比較,相對標準偏差均小于5%,表明本方法測量準確性良好,適用于實際樣品米粉中維生素E的測定。

表4 在線固相萃取-液相色譜法測定米粉樣品中維生素E的結果

3 結 論

本文建立了在線固相萃取-液相色譜法同時測定米粉中4種維生素E含量的方法。本方法利用固相萃取取代傳統的液液萃取,降低了石油醚等有機試劑的使用數量,節約了實驗成本。此外,將固相萃取柱與液相色譜儀在線耦合,實現了自動化分析,有效避免人工操作帶來的實驗誤差,提高了檢測效率。經驗證,該方法回收率和重復性良好,適用于檢測日常米粉樣品。