乳酸菌富硒及其體外抗氧化能力的研究

胡陸軍，曹雨瀾，陳曉蝶，徐騰，周云川

（1.四川輕化工大學生物工程學院，四川 宜賓 644000；2.宜賓郭滿堂生態食品有限公司，四川 宜賓 644000）

引言

硒是人體必需的微量元素之一，是谷胱甘肽過氧化物酶的活性中心元素[1]，與機體氧化防御系統以及多種疾病密切相關[2]。但是，硒在全球的分布極不均衡，超過2/3 的人口生活在低硒地帶[3]，當人體持續硒攝入不足時會導致生殖障礙、免疫缺陷和克山病等[4]?，F階段，我國缺硒現象普遍存在，成人每日硒平均攝入量僅26.3 μg[5]。研究發現，成人每日硒的攝入量應不低于40 μg[6]，才能基本維持硒酶在人體內的活性。而僅靠從天然食物攝取難以滿足人體對硒的需求[7]。在自然界中，硒按其結合形態可分為有機硒和無機硒，有機硒安全且生物利用度更高[8]，具有抗癌[9]、抗菌[10]、抗病毒[11]、抗氧化等藥理活性以及神經保護作用[12]；無機硒如亞硒酸鈉和硒酸鈉等化合物則表現出較高的遺傳毒性[12]。大量研究表明無機硒可被微生物利用、轉化和積累[13]，是轉化為有機硒從而為人體補充硒的良好硒源。

乳酸菌是目前食品發酵行業應用最為廣泛的微生物，具有突出的微量元素富集能力[14]，有機硒積累方面也表現出良好的生物安全性和高效的無機硒轉化率[15]。無機硒能以化學吸附形式與乳酸菌等微生物在胞外結合[16]，進入細胞后再通過乳酸菌代謝將無機硒與體內的生物大分子結合形成硒蛋白、硒多糖或析出單質硒等富硒物質[17]，毒性大大降低。大量研究表明乳酸菌在富硒方面具有優越的表現，如從伊朗傳統乳制品中分離出的短乳桿菌，能耐受3.16 mmol·L-1亞硒酸鈉，具有較強的硒耐受性[18]。王麗紅等[19]將植物乳桿菌接入改良后的含硒MRS培養基中，發現菌株生長繁殖能力增強，合成的納米硒顆粒也更均勻、穩定，富硒率為1.3 g/L。

基于此，為了探究不同種屬乳酸菌的富硒能力，本研究以實驗室篩選并保存的3 種乳酸菌為研究對象，分析乳酸菌對亞硒酸鈉的耐受性及其在硒環境中表觀結構的變化，并以此為基礎進一步研究乳酸菌富硒能力和體外抗氧化能力，從而為富硒乳酸菌及其發酵食品的研發提供理論基礎和實踐依據，滿足人體對硒的需求和改善硒缺乏現狀。

1 材料與方法

1.1 菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）3 株（分別為ZW19、ZW107、ZW109）；戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）3 株（分別為WT89、WT111、WT125）和短乳桿菌（Lactobacillus brevis）3 株（分別為DR91、DR93、DR104），共9株乳酸菌，均來源于發酵食品。

1.2 試劑

無水亞硒酸鈉（Na2SeO3）、乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA-2Na）、3,3’-二氨基聯苯胺（DAB）均為AR，購于成都西亞化工股份有限公司；鹽酸（AR）購于重慶川東化工有限公司；氫氧化鈉、叔丁醇均為AR，購于成都市科隆化學品有限公司；甲苯（AR）購于重慶化工有限公司；2.5%的戊二醛電鏡固定液購于以達科技有限公司；超氧陰離子含量檢測試劑盒與羥自由基清除能力試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 儀器與設備

生物顯微鏡（SK210，麥克奧迪實業有限公司）；分光光度計（UV-1601，北京北分瑞利分析儀器有限責任公司）；pH 計（PHS-10，成都世紀方舟科技有限公司）；真空冷凍干燥機（SCIRNTZ-10N，寧波新芝生物科技股份有限公司）；掃描電子顯微鏡（VEGA3SBU，捷克Tesan公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 乳酸菌菌株硒元素耐受性測定

將乳酸菌培養至對數前期，以4%的接種量接種于含50 μg/mL亞硒酸鈉的MRS液體培養基中，每組做3 次平行試驗，于37 ℃培養箱中培養24 h。利用比濁法測定菌液的OD600nm吸光度，分析乳酸菌菌株對硒元素的耐受性。

1.4.2 乳酸菌富硒能力測定

1.4.2.1 硒母液與DAB溶液的配制

將Na2SeO3溶于蒸餾水中配制成1 mg/mL Na2SeO3母液。將DAB 溶于1 mol/L 的鹽酸配制成0.5wt% DAB溶液。

1.4.2.2 亞硒酸鈉標準曲線的繪制

以1 mg/mL 的Na2SeO3母液為基礎配制濃度為10 μg/mL 的Na2SeO3標準溶液。分別吸取硒濃度為10 μg/mL 的Na2SeO3標準溶液0、2、4、6、8、10 mL 至錐形瓶內，加蒸餾水定容至35 mL，隨后加入1 mL的5wt%的EDTA-2Na 溶液，混勻。用HCl 調pH 值至2～3，混勻后 避光反 應 30 min。加 入 4 mL 0.5wt% DAB 溶液，用NaOH 調pH 至中性；最后加入10 mL 甲苯，混勻，確保無機硒被甲苯充分萃取，溶液置于暗處分層，棄水層，收集甲苯層于比色皿中。在波長420 nm 處用紫外分光光度計測定濾液的吸光度，繪制標準曲線[20]。

1.4.2.3 乳酸菌富硒率的測定

乳酸菌富硒率的測定參考楊鶴等[21]的方法稍做修正。取3 mL 菌液于離心機中在6000 r/min 條件下離心10 min。取2.8 mL 上清液于錐形瓶中，加蒸餾水至35 mL，再加入1 mL 5wt% EDTA—2Na 溶液。測定方法與硒元素標準曲線相同，根據樣品在波長420 nm 處測得的吸光度，在標準曲線中計算出相應的硒含量，所得值即為無機硒含量，用總硒含量減去無機硒含量即得到菌株富硒量。乳酸菌富硒率計算公式如下：

1.4.3 掃描電鏡分析乳酸菌表觀結構

將富硒乳酸菌于離心機中在6000 r/min 條件下離心20 min，棄上清液，加入2.5%(vol)戊二醛電鏡固定液固定，渦旋震蕩5 min，置于4 ℃條件下避光處理2 min，經6000 r/min 離心20 min，棄去上層清液。用pH 值為7.2 的磷酸緩沖溶液清洗，隨后用不同濃度的乙醇進行梯度洗脫（加乙醇溶液后渦旋震蕩5 min，靜置5 min，再以6000 r/min 轉速離心5 min），棄上清液，用叔丁醇置換乙醇，將樣品進行真空冷凍干燥，樣品噴金后進行電鏡掃描分析[22]。

1.4.4 富硒乳酸菌的抗氧化能力測定

參照超氧陰離子含量檢測試劑盒與羥自由基清除能力試劑盒說明書，分別對含有和不含有亞硒酸鈉溶液的MRS 液體培養基中的乳酸菌菌株抗氧化能力進行測定。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌菌株耐硒能力分析

乳酸菌對50 μg/mL Na2SeO3的耐受性如圖1 所示。通過比較乳酸菌在含有和不含有Na2SeO3的MRS 培養基中乳酸菌的生長狀況來反映乳酸菌對Na2SeO3的耐受性，通過測定乳酸菌在600 nm 處的吸光度值來反映乳酸菌的生長狀況。

圖1 乳酸菌對50 μg/mL Na2SeO3的耐受性(NS表明無顯著性差異)

從圖1 可知，9 株乳酸菌在含有和不含50 μg/mL Na2SeO3的MRS 培養基中培養后，這9 株乳酸菌生長都沒有顯著性差異，因此，這9株乳酸菌對50 μg/mL Na2SeO3都表現出較好的耐受性。其中，植物乳桿菌ZW109、戊糖片球菌（WT89、WT111、WT125）、短乳桿菌（DR91、DR93、DR104）富硒后的菌體生物量相對于未富硒的菌體生物量有所下降，但是和對照組之間沒有顯著性差異。這表明50 μg/mL Na2SeO3未對菌株發育繁殖造成影響，與其他研究結果一致[23]。當硒元素濃度較低時可以促進乳酸菌的生長，但高濃度的硒元素則會抑制生長、導致菌體細胞破損甚至造成乳酸菌死亡[24]。

2.2 乳酸菌菌株富硒能力分析

利用硒元素與DAB 在酸性的條件下生成黃色絡合物質這一特性，通過測定不同濃度Na2SeO3標準溶液在420 nm 波長下吸光度確定硒元素含量[24]。利用DAB 比色法對Na2SeO3標準曲線進行繪制，如圖2 所示，其回歸方程為y=0.00518x+0.00919（R2=0.998），這表明該模型線性擬合程度較好，可用于后續相關結果分析。

圖2 亞硒酸鈉標準曲線

利用DAB 比色法測定不同乳酸菌菌株富硒率，結果如圖3 所示。植物乳桿菌ZW19、ZW107 和ZW109 的富硒率分別為65.35%、65.63%和62.59%，經計算富硒量分別為490.13、492.20、469.44 μg/mL；戊糖片球菌不同菌株之間存在顯著差異，其中WT111 富硒率為54.18%，富硒量為406.35 μg/mL。短乳桿菌3 菌株之間也存在顯著性差異，其中DR104 富硒率最高為 64.52%，富硒量為483.92 μg/mL，該菌株富硒率顯著高于另外兩株短乳桿菌。這與已有研究發現的不同來源的同種乳酸菌富硒特性不同的結果具有一致性[25]。

圖3 乳酸菌富硒率種內差異

乳酸菌富硒率種間差異如圖4 所示，圖中可見，3 種菌富硒率存在顯著的種間差異，植物乳桿菌富硒率最高，戊糖片球菌富硒率次之，短乳桿菌富硒率最低。已有研究發現不同種屬乳酸菌富硒能力不同[25]，M?rschb?cher等[23]研究發現在添加150 mg/L Na2SeO3培養液中培養后，與糞腸球菌、擬布氏乳桿菌和植物乳桿菌相比，副干酪乳桿菌表現出最佳富硒能力。王翼雪等[2]研究發現，相對于嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌而言，植物乳桿菌具有更高的富硒率。因此，乳酸菌富硒能力的差異不僅與菌株有關，還與菌種有關。

圖4 乳酸菌富硒率種間差異

2.3 富硒乳酸菌表觀形態觀察

為研究Na2SeO3對乳酸菌菌體細胞形態的影響，用掃描電鏡對富硒率較高的4 株乳酸菌ZW19、ZW107、ZW109 和 DR104 在 50 μg/mL Na2SeO3條件下菌株細胞表觀結構進行觀察，4 株乳酸菌的掃描電鏡結果如圖5所示。

圖5 乳酸菌掃描電鏡圖（× 20 000）

從圖5 可見，4 株乳酸菌對照組與實驗組的菌體形態和表觀結構并未發生明顯變化。植物乳桿菌ZW19、ZW107 和ZW109 在50 μg/mL Na2SeO3條件下仍然呈現與對照組（圖5(a)、圖5(b)和圖5(c)）相似的 經典的 短桿狀[26]，長0.42～0.67 μm，寬0.67～5.20 μm，短乳桿 菌DR104 在50 μg/mL Na2SeO3條件下與對照組均呈現相同的較短桿狀[27]，長 1.00～2.17 μm，寬 0.87～1.04 μm。經Na2SeO3處理后的菌體表面光滑完整、界限清晰，形態飽滿無收縮破裂現象。因此，50 μg/mL Na2SeO3對4 株乳酸菌的表觀結構無影響，這表明4 株乳酸菌對50 μg/mL 的Na2SeO3具有較強耐受性。

富硒后的植物乳桿菌ZW107 電鏡圖如圖6 所示，圖中可見，細胞表面有明顯的微小球狀顆粒，這可能是植物乳桿菌合成并析出了單質硒[15]。在其他研究中也有相同的發現。比如，Xu 等以含1.2 mmol/mL Na2SeO3培養液培養干酪乳桿菌能產出大量50～80 nm 的硒納米顆粒[28]。Martínez等[29]通過SEM 觀察發酵飲料中的硒化短乳桿菌，也清楚地觀察到納米硒。

圖6 富硒后ZW107電鏡圖（× 5000）

2.4 富硒乳酸菌抗氧化能力分析

富硒乳酸菌抗氧化能力結果如圖7 所示，圖中可見，9 株乳酸菌富硒后超氧陰離子均顯著降低，而羥基自由基清除能力顯著提高。因此，9 株乳酸菌菌株經過富硒后表現出良好的抗氧化能力。特別地，植物乳桿菌ZW19、ZW107、ZW109和短乳桿菌ZW104 具有更突出的抗氧化活性，這與菌株富硒能力的研究結果一致。乳酸菌富硒后可以顯著提高抗氧化能力，如Hyrslova等[30]研究發現富硒的嗜熱鏈球菌具有更高的抗氧化活性；同樣Shakibaie等[18]發現短乳桿菌在含硒培養基中培養后該菌株抗氧化活性顯著高于無硒培養基中培養的短乳桿菌，自由基的清除率達到36.5% ± 1.31%，p＜0.05。

圖7 富硒乳酸菌抗氧化能力

超氧陰離子是大多數活性氧簇（ROS）的前體和氧化鏈反應的介質[31]，具有抗氧化能力的富硒乳酸菌能夠有效清除活性氧和自由基[32]。當細胞受到無機硒脅迫時產生氧化應激反應，細胞會合成用于ROS解毒和修復大分子氧化損傷的谷胱甘肽過氧化物酶（GSH—Px）、硫氧還蛋白還原酶（TrxR）和其他氧化還原酶類來抵御氧化應激[31]。這些酶是乳酸菌通過自身代謝形成含有硒半胱氨酸殘基的硒蛋白，以硒酶的形式在機體中發揮抗氧化功能[33]。GSH—Px 以硒為活性中心元素，催化過氧化氫和各種有機過氧化氫，將其還原成無害的水和相應的醇[34]，TrxR 是以NADPH 為電子供體的二聚體硒酶，通過催化調節氧化的硫氧還蛋白還原而發揮抗氧化作用[35]。此外，還有其他氧化還原酶形式，如甲酸脫氫酶和甘氨酸還原酶可賦予細胞抗氧化特性[36]。

3 結束語

通過研究乳酸菌菌株對硒耐受性發現添加50 μg/mL 亞硒酸鈉未對乳酸菌的生長繁殖造成影響。進一步對乳酸菌菌株富硒能力研究發現，植物乳桿菌富硒能力均高于戊糖片球菌和部分短乳桿菌，戊糖片球菌WT89、WT125 和短乳桿菌DR91、DR93 的富硒能力相對較低。此外，分別對4 株高富硒能力乳酸菌菌株（ZW19、ZW107、ZW109 和DR104）進行電鏡觀察，結果顯示加硒培養后4 株乳酸菌菌體的形態和表觀結構并未發生變化，且富硒后的植物乳桿菌ZW107 細胞表面有單質硒顆粒析出。最后，對乳酸菌菌株進行超氧陰離子含量與羥自由基清除能力測定，發現9 株乳酸菌的實驗組均比對照組顯示出更高的抗氧化活性。本研究對不同種屬的乳酸菌富硒能力進行了初步研究，并對其富硒后的體外抗氧化活性進行了測定，然而，對于其具體作用機理有待進一步探究。