五味化痔膠囊對痔模型大鼠炎癥因子和PI3K/AKT/NF-κB信號通路的影響*

河北中醫藥大學

韓世誠 王智森△ 高 飛△ 王 茜△△ 關勝江△△△ 趙勝男 陸艾陽子△△△△ 石 鋮 陳 健 張一昕 柴天川△△△(石家莊 050091)

提要 目的：研究五味化痔膠囊對痔模型大鼠肛周腫脹、潰瘍、出血等癥狀，直腸組織病理形態學，炎癥因子，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/核因子κB(PI3K/AKT/NF-κB)信號通路表達的影響，探究其治療痔病的作用機制。方法：SD大鼠分為空白組、模型組、美沙拉嗪組、五味化痔膠囊低、中、高劑量組。選用角叉菜膠、脂多糖、山莨菪堿、酚磺乙胺混合液，注射于大鼠肛腸局部復制大鼠痔模型。造模后，中藥各組予五味化痔膠囊干預7 d，觀察肛周腫脹、潰瘍、出血等癥狀表現，HE染色觀察直腸組織病理形態，酶聯免疫吸附試驗檢測組織勻漿中炎性因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)以及白介素-6(IL-6)的水平，qRT-PCR技術觀察直腸組織中PI3K、AKT、NF-κB的基因表達，免疫組化法觀察直腸組織環氧化酶2(COX2)及誘導型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表達。結果：與空白組相比，模型組肛周腫脹、潰瘍、出血等癥狀評分升高(P<0.05)，光鏡下觀察到直腸組織黏膜缺損、間質血管擴張充血、炎性細胞浸潤等情況；血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平上升(P<0.05)，直腸組織中PI3K、AKT、NF-κB的mRNA表達及COX2、iNOS蛋白表達升高(P<0.05)。與模型組相比，美沙拉嗪組和五味化痔膠囊高、中劑量組癥狀評分下降(P<0.05)，直腸組織黏膜缺損、間質血管擴張充血、炎性細胞浸潤等情況有所緩解；美沙拉嗪組和五味化痔膠囊高、中、低劑量組IL-1β、IL-6和TNF-α水平下降(P<0.05)，PI3K、NF-κB mRNA表達和COX2、iNOS蛋白表達下降(P<0.05)，五味化痔膠囊高劑量組AKT mRNA表達下降(P<0.05)。結論：五味化痔膠囊可能通過抑制PI3K/AKT/NF-κB通路、調節炎癥因子的水平治療痔病。

痔病是一種常見的肛腸疾病，其主要癥狀包括肛門疼痛、肛門瘙癢、便血等。研究表明[1]，我國居民肛腸疾病發病率約為51.14%，其中以痔的發病率最高，為50.28%。雖然外科手術治療是治療痔病最直接的方法，可以快速消除痔組織，但患者的接受度較差，常選擇保守治療[2]。中醫采用內服、熏洗坐浴、外敷等方法在痔的保守治療方面具有顯著的優勢。

五味化痔膠囊是在中醫理論指導下，總結多年臨床實踐經驗，結合現代藥理研究，精選藥物，合理組方研制而成，主要由酒大黃、炒地龍、煅石決明、珍珠和人工牛黃組成，治療痔瘡濕熱壅滯證可起到標本兼治之效。方中大黃性味苦寒，既能瀉下攻積、清利濕熱，祛除體內濕熱邪氣以治其本，又能涼血止血、化瘀解毒，緩解便血、肛門腫痛，口干口苦等癥，以治其標，故為君藥；人工牛黃清熱解毒，地龍通經活血，輔助大黃化瘀解毒，共為臣藥[3]；石決明、珍珠能夠解毒生肌，促進腸黏膜恢復[4]，五藥相合，共奏清泄濕熱、解毒行瘀、涼血祛風之功。前期研究證明，五味化痔膠囊治療痔病有較好的止血、消腫、止痛之功[5]?，F代研究發現[6]，痔的發病與炎癥反應密切相關，為了進一步探究五味化痔膠囊治療痔病的作用機制，本文通過建立大鼠痔模型，觀察大鼠肛周腫脹、潰瘍、水腫、充血等情況，直腸組織病理形態學變化，炎癥因子及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/核因子κB(PI3K/AKT/NF-κB)通路相關基因、蛋白的表達，以期為指導臨床應用提供更翔實的數據支撐。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體質量180～220 g，生產許可證號：SCXK(遼)2020-0001。均由遼寧長生生物技術有限公司提供。實驗動物飼養于恒溫恒濕實驗室內，自由進食飲水。該實驗經河北中醫藥大學倫理委員會批準同意，編號YXLL2021045。

1.2 實驗藥物 五味化痔膠囊(酒大黃、地龍、石決明、珍珠、人工牛黃)、美沙拉嗪(葵花藥業集團佳木斯鹿靈制藥有限公司，批號：H19980148)，分別用0.5%羧甲基纖維素鈉配置到實驗所需濃度；角叉菜膠干粉(上海易恩化學技術有限公司，批號：RH328493)和脂多糖(Solarbio公司，貨號L8880)分別用生理鹽水配成1%的角叉菜膠溶液和0.5%的脂多糖溶液；酚磺乙胺(新鄉市常樂制藥有限責任公司，批號：H4102151)和鹽酸消旋山莨菪堿注射液(安徽長江藥業有限公司，批號：H34021816)，以原劑型按照說明書劑量使用。

1.3 實驗試劑 羧甲基纖維素鈉[阿拉丁試劑(上海)有限公司，批號：C299502]，SuperScriptTMIV First-Strand Synthesis System試劑盒批號(Igenebio公司，批號：QP057)、BlazeTaqTMSYBR?Green qPCR mix 2.0試劑盒批號(Igenebio公司，批號：QP042)、腫瘤壞死因子α(TNF-a)、白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)ELISA檢測試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，批號分別為：L221130959、L221228223、L230106753)，環氧化酶2(COX2)抗體(Boster公司，批號：BA0738)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)抗體(Santa公司，批號：sc-7271)。

1.4 主要實驗儀器 RM2016型病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)，H17502型冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)，JB-P5型包埋機(武漢俊杰電子有限公司)，GL1241-1SCN型電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]，BX43F型顯微鏡[奧林巴斯(中國)有限公司]，iChem-530型全自動生化分析儀(深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 模型復制 按照參考文獻[7]，采用多藥物聯合應用方法復制痔病模型：于大鼠肛門以內0.2 cm，4點位黏膜下漿肌層處，注射角叉菜膠溶液100 μL+脂多糖溶液10 μL+山莨菪堿注射液20 μL+酚磺乙胺注射液30 μL，每日1次，連續7 d。

2.2 分組及給藥 實驗動物適應性喂養7 d，隨機分為空白組、模型組、美沙拉嗪組(0.4 g/kg)、五味化痔膠囊低劑量組(0.15 g/kg)、中劑量組(0.3 g/kg)、高劑量組(0.6 g/kg)，每組10只，各組動物劑量根據人與動物體表系數折算。其中空白組、模型組灌胃給予生理鹽水，美沙拉嗪組及五味化痔膠囊高、中、低劑量組給予相應藥液，每次用藥體積為1 mL/100 g，1次/d，連續7 d。

2.3 標本采集 末次給藥后，禁食不禁水12 h，腹主動脈取血，離心15 min(4 000 r/min)，分離血清，待檢炎性因子指標；隨后立即剖腹，切取肛管至直腸段2 cm范圍組織，縱向一分為二，一份置于4%多聚甲醛中進行固定，另一份置于凍存管中液氮凍存，以備檢測相關基因、蛋白的表達。

2.4 一般情況觀察 實驗期間，記錄各組大鼠的宏觀體征變化，每日定時稱重，記錄飲食、排便等情況；測量大鼠肛周直徑(用游標卡尺精確測量3次，取平均值)評價其腫脹程度，觀察大鼠肛周炎性滲出及潰瘍、紅腫情況，并按照表1進行評分。

表1 痔模型大鼠肛周癥狀評分標準

2.5 HE染色法觀察直腸組織病理形態學變化取4%多聚甲醛溶液固定的組織，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察直腸組織病理形態學變化。

2.6 ELISA法檢測大鼠直腸組織中炎癥指標水平 根據ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測大鼠直腸組織勻漿中TNF-α、IL-1β以及IL-6的水平。

2.7 PI3K、AKT、NF-κB mRNA的表達 取直腸組織約150 mg，加入裂解液，提取總RNA，按照25 ℃ 5 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min的程序反轉錄為cDNA后，加入擴增反應體系，進行檢測。PCR反應條件為20 μL體系，95 ℃30 s，95 ℃10 s，60 ℃30 s，40個循環。按照相對定量方法分析，以GAPDH作為內參，結果通過2-ΔΔct方法計算。引物序列見表2。

表2 引物序列表

2.8 免疫組織化學染色觀察COX2及iNOS蛋白表達 根據檢測試劑盒說明書操作，將常規石蠟包埋的組織切片放入60℃溫箱烘l h；二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；孵育30 min，使用PBS沖洗3次；抗原修復后，加入一抗，孵育后滴加二抗；經DAB染色、脫水、透明后干燥封片，顯微鏡下觀察COX2及iNOS蛋白表達，用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行圖像分析與處理。

2.9 統計方法 采用IBM SPSS25.0軟件進行數據分析，正態性檢驗，符合正態分布采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩比較采用SNK-q法。不符合正態性或方差不齊，則采用Kruskal-WallisH秩和檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況的比較 空白組大鼠精神狀態良好，飲食、排便情況正常。與空白組相比，模型組大鼠出現精神萎靡，活潑程度減小，出現肛周腫脹、潰瘍等癥狀，癥狀評分顯著升高(P<0.05)，肛周直徑有升高趨勢(P>0.05)，提示痔病模型成功復制。經美沙拉嗪以及五味化痔膠囊中、高劑量給藥治療后，大鼠活潑程度有不同程度的改善，潰瘍及腫脹程度有所降低，癥狀評分降低(P<0.05)，肛周直徑有下降趨勢(P>0.05)，提示美沙拉嗪和五味化痔膠囊均有較好的治療作用，但兩者比較差異無統計學意義。詳見表3。

表3 各組大鼠肛周直徑和癥狀評分變化

3.2 各組大鼠直腸病理組織形態 空白組黏膜上皮形態結構基本正常，腺體排列較為整齊。在模型組中，直腸黏膜缺損、結締組織增生、腺體排列紊亂，間質可見血管擴張充血，伴炎癥細胞浸潤。美沙拉嗪組直腸黏膜上皮增生，腺體排列稍有紊亂，間質偶發血管擴張充血，偶見炎癥細胞浸潤。五味化痔膠囊低、中劑量組，腺體排列紊亂，間質可見血管擴張充血，偶見炎癥細胞浸潤。高劑量組直腸黏膜上皮增生，腺體排列稍有紊亂，間質偶發血管擴張充血，偶見炎癥細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠直腸組織病理學改變(100×)

3.3 各組大鼠直腸組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平 與空白組比較，模型組大鼠直腸組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平均升高(P<0.05)；與模型組相比，美沙拉嗪組與五味化痔膠囊低、中、高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著降低(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠直腸組織勻漿中IL-6、IL-1β及TNF-α水平比較

3.4 各組大鼠直腸組織PI3K、AKT、NF-κB mRNA的表達 與空白組相比，模型組直腸組織PI3K、AKT、NF-κB mRNA表達均升高(P<0.05)；與模型組相比，美沙拉嗪組、五味化痔低、中、高劑量組PI3K、NF-κB mRNA表達降低(P<0.05，P<0.05)，美沙拉嗪組和五味化痔高劑量組AKT mRNA表達下降(P<0.05)。詳見表5。

表5 各組大鼠直腸組織中PI3K、AKT、NF-κB mRNA的表達

3.5 各組大鼠直腸組織COX2及iNOS蛋白表達與空白組比較，模型組大鼠COX2、iNOS表達明顯升高(P<0.05)，與模型組比較，美沙拉嗪組與五味化痔膠囊低、中、高劑量組COX2、iNOS表達下降(P<0.05)。詳見表6。

表6 各組大鼠直腸COX2、iNOS平均光密度的比較

4 討論

中醫學對痔的病因病機及治則、治法的闡述古已有之，《山海經·西山經》是最早記載痔的古籍[8]?！端貑枴ど鷼馔ㄌ煺摗费裕骸耙蚨柺?，筋脈橫解，腸澼為痔?！敝赋隽耸硽鉁?，濕熱之氣癖積于陽明大腸而為痔[9]?！段迨》健纷钤鐚⒅谭譃椋耗抵?、牝痔、脈痔、血痔，提出“絜以小繩，剖以刀”的治療方法[10]?！兜は姆ā吩疲骸爸陶?，皆因臟腑本虛，外傷風濕，內蘊熱毒，醉飲交接，多欲自戕，以致氣血下墮，結聚肛門，宿滯不散，而沖突為痔也?！盵11]《醫宗金鑒》提出“痔瘡形名亦多般，不外風濕燥熱源”，講述了痔瘡的病因為風、濕、燥、熱等[12-13]。課題組認為，痔發病多為外感六淫、飲食不節、腸澼或長期便秘努掙、久行久坐、久咳等，致使臟腑功能紊亂，濕熱蘊結于魄門，日久發而為痔，臨床通常表現為疼痛、腫脹、痔核脫出、便血等癥狀。濕熱毒瘀為其基本病機，清泄濕熱、解毒行瘀為其有效治法，故根據臨床經驗創制了五味化痔膠囊。為了進一步探究五味化痔膠囊的作用機制，本研究基于痔病肛管局部靜脈曲張、瘀滯、局部炎癥、微循環障礙等病理特征及藥理學原理，選用了微循環阻滯劑、腸道平滑肌運動抑制劑及致炎、致腫脹試劑以合適劑量聯合應用復制痔動物模型[7]。首先，通過確定肛周癥狀評分標準，觀察直腸組織病理形態學變化，證明了五味化痔膠囊能明顯改善痔模型大鼠肛周潰瘍、腫脹等癥狀，緩解直腸組織上皮增生、間質血管擴張充血，炎癥細胞浸潤等病理改變，提示其治療痔病確實具有較好的療效。其次，根據痔的病理特征主要是由炎癥細胞及其釋放的炎癥介質引起毛細血管擴張，導致血管通透性增加所致，本研究從炎癥通路角度揭示其作用機制。研究發現，TNF-α、IL-1β以及IL-6在痔的炎癥反應中發揮了重要作用。其中TNF-α參與炎癥反應的所有階段，并有促進炎癥介質分泌的作用，加重痔導致的水腫并會引發炎性細胞浸潤，其含量的降低有助于減輕炎癥反應和促進愈合。IL-6是參與調劑免疫功能及細胞相互作用的細胞因子，是評價創面炎癥程度以及愈合程度的重要指標[14]。IL-1β主要由單核巨噬細胞產生，具有促進炎癥細胞分泌、活化的作用，可提高內皮細胞通透性，加重腸道炎癥反應[15]。IL-1β參與了IL-6和TNF-α的調節，為典型的多功能細胞因子，幾乎對所有組織的細胞防御和組織修復至關重要，與痔病發生引起的疼痛、炎癥密切相關。痔出現后局部組織損傷，創面難以愈合，巨噬細胞升高并參與炎癥反應，引起TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高，而在炎癥反應中TNF-α與IL-6都具有炎癥聯級放大反應，從而激活更多炎癥介質的表達，加重炎癥反應[16]。本實驗結果表明，五味化痔膠囊可以顯著降低大鼠腸道組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平，減輕直腸組織中的炎癥反應。美沙拉嗪是一種常見的氨基水楊酸制劑，廣泛應用于各類炎癥性腸病，其藥理機制主要在腸道黏膜上發揮作用，通過抑制促炎因子的合成，以實現抗炎癥效應。其能夠導致黏膜完全愈合的發生率約為35%[17]?？梢种瓢捉樗?、白三烯、前列腺素E2等多種炎癥因子的產生而降低腸道炎癥反應，可改善因炎癥導致的腸道充血、水腫、出血、疼痛等癥狀，與痔病炎癥反應癥狀相似，故將美沙拉嗪作為陽性藥，評價五味化痔膠囊的抗炎效果[18-19]。結果顯示，五味化痔膠囊各劑量組抗炎效果與美沙拉嗪相似，無統計學差異。

PI3K是胞內信號轉導的脂類第二信使，與痔病所產生的炎癥反應密切相關，作為PI3K的下游靶點，AKT直接參與信號傳遞[20]，當PI3K激活后，AKT作為下游因子被磷酸化，激活的AKT可以通過多種途徑促進NF-κB的激活和核轉位，進而影響炎癥相關基因的表達[21-22]。同時，NF-κB還能調控下游COX2和iNOS的轉錄，促進炎癥反應的發生。其中COX-2在炎癥狀態下表達顯著增加，促使炎癥細胞產生大量炎癥介質，導致炎癥部位出現紅、腫、熱、痛，從而加重痔病引起的潰瘍[13，23]；iNOS是細胞內重要的功能酶，能夠誘導NO的產生，促進痔組織炎癥部位TNF-α、IL-1β以及IL-6等炎性因子的滲出，加劇炎癥損傷及誘導疼痛反應[24-25]，二者在炎癥期間可相互作用，iNOS可誘導COX-2的表達，COX-2亦可促進iNOS的表達[26-29]，從而加重痔組織的炎癥表現。本實驗結果表明，五味化痔膠囊能下調痔模型大鼠直腸組織PI3K、AKT和NF-κB mRNA表達水平，減輕相關炎癥介質COX-2以及iNOS的表達，從而改善痔模型大鼠的炎癥反應。

綜上所述，五味化痔膠囊可有效緩解痔病相關癥狀，可能是通過抑制PI3K/AKT/NF-κB信號通路，降低炎性因子水平來發揮治療作用的。本研究結果為推動五味化痔膠囊的臨床應用提供了有益借鑒，但其具體作用靶點及物質基礎還有待深入系統研究加以驗證。