補腎溫陽化瘀方對子宮內膜異位癥大鼠PKC信號通路的影響*

河北中醫藥大學中西醫結合學院/河北省中西醫結合肝腎病證研究重點實驗室

張英美 羅 琳 牛若冰 胡書嬋 朱 晗 孫 瑩 賀 明(石家莊 050200)

提要 目的：研究補腎溫陽化瘀方治療子宮內膜異位癥(EMs)的作用，探討其調控蛋白激酶C(PKC)信號通路的機制。方法：將50只SPF級8～10周齡雌性SD大鼠隨機分為5組，分別為假手術組、模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組和西藥組，每組10只。采用自體移植法復制EMs大鼠模型，造模成功后分別給予補腎溫陽化瘀方低、高劑量及孕三烯酮灌胃，假手術和模型組灌胃蒸餾水，連續21 d。HE染色觀察在位內膜及異位灶的病理形態改變；Western blot測定在位內膜及異位灶磷酸化蛋白激酶C的α亞型(p-PKCα)、蛋白激酶C的α亞型(PKCα)蛋白的表達水平。結果：模型組在位內膜和異位灶p-PKCα蛋白水平升高；給予補腎溫陽化瘀方治療后，p-PKCα的蛋白表達水平降低(P<0.05)，PKCα的蛋白表達水平無明顯變化。結論：補腎溫陽化瘀方通過抑制PKC信號通路來治療EMs。

子宮內膜異位癥(EMs)是指子宮內膜組織(腺體和間質)生長在子宮腔被覆內膜及子宮以外的部位，簡稱內異癥。其發病率逐年上升，僅次于婦科炎癥性疾病和子宮肌瘤[1]。在育齡女性中，內異癥的總體患病率約10%[2]。補腎溫陽化瘀方應用于臨床多年，臨床療效顯著[3]。蛋白激酶C(PKC)是蛋白激酶家族中的一員，通過調節細胞增殖、黏附、遷移、侵襲和凋亡[4-5]等病理生理過程發揮重要作用。本研究通過觀察補腎溫陽化瘀方對PKC信號通路的影響，探討補腎溫陽化瘀方治療EMs的可能分子機制。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級雌性SD大鼠50只，8～10周齡，體質量(220±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK(京)2021-0011。

1.2 實驗藥物 補腎溫陽化瘀方(組成：炮附子6 g，肉桂、小茴香各10 g，黨參、炒白術各15 g，川芎、制沒藥各10 g，川楝子15 g，川牛膝10 g，桑寄生、狗脊各30 g，吳茱萸9 g等)購于樂仁堂藥房，制成精制混懸液；中藥低劑量組生藥濃度3.9 g/mL，中藥高劑量組生藥濃度7.8 g/mL。異氟烷(瑞沃德生命科技有限公司，20110401)；孕三烯酮膠囊(北京紫竹藥業有限公司，3210301)；戊酸雌二醇片(拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司，684A)；硫酸慶大霉素注射液(石藥集團歐意藥業有限公司，068210502)。

1.3 主要試劑 蛋白激酶C的α亞型(PKCα)抗體(proteintech，21991-1-AP)；磷酸化蛋白激酶C的α亞型(p-PKCα)、抗體(abcam，ab23513)；GAPDH(proteintech，60004-1-IG)；HRP標記的山羊抗兔IgG(Abbkine，A21020)；HRP標記的山羊抗鼠IgG(Abbkine，A21010)；伊紅染色液(北京索萊寶科技有限公司，G1108)；蘇木素染色液(北京索萊寶科技有限公司，G1080)。

1.4 主要儀器 小動物麻醉機(美國MIDMARK公司，型號：VMR)；病理圖文分析系統(日本，型號：DP72CCD)；切片機(德國LEICA，型號：RM2245)；攤烘烤片一體機(維克科教儀器有限公司，型號：VCM-TK7218)；低溫高速離心機(基因有限公司，型號：173R)；分光光度計(基因有限公司，型號：NANODROP 2000C)；垂直電泳槽(美國伯樂公司，型號：Mini PROTEAN?Tetra Cell)；電泳儀(美國伯樂公司，型號：PowerPacTMUniversal Power Supply)；半干式轉膜儀(美國伯樂公司，型號：Trans-Blot SD Cell)；化學發光系統(易孛特生命科學有限公司，型號：Touch Imager)

2 方法

2.1 動物模型建立 大鼠適應性喂養1 w后，按隨機數字表法分為5組，每組10只，分別為假手術組、模型組、中藥低、高劑量組和西藥組。采用自體移植法建立內異癥大鼠模型[6]。戊酸雌二醇片灌胃3 d，期間陰道涂片觀察大鼠處于統一動情周期后，予以異氟烷麻醉，取大鼠尿道口正上方約2 cm 處開腹，剪右側子宮中段(約2 cm)，立刻放置于生理鹽水中，剝離干凈后縱形剖開子宮，將子宮內膜面緊貼在左側腹壁上，然后縫合固定在腹腔內壁。假手術組只開腹不造模。為預防術后感染，造模后給予慶大霉素腹腔注射，連續3 d，術后第4 d開始給藥治療。補腎溫陽化瘀方低、高劑量組分別給予相應劑量19.4 g/kg 、38.8 g/kg灌胃，1次/d；孕三烯酮組灌胃劑量同臨床等效劑量，即0.25 mg/kg，2次/w；假手術組、模型組及孕三烯酮組非給藥時間均給與同體積蒸餾水灌胃，連續21 d。

2.2 組織的收集與處理 采用異氟烷對大鼠進行麻醉后，觀察腹壁異位灶形態，取異位灶和在位子宮組織，部分組織采用 4%多聚甲醛溶液固定，剩余組織置于-80℃冰箱保存。

2.3 一般狀況觀察 開腹后觀察大鼠異位灶組織生長情況。

2.4 HE染色觀察各組大鼠異位灶病理形態 大鼠組織切片按常規步驟處理后，采用蘇木素和伊紅染液分別進行細胞核和細胞質染色，顯微鏡下觀察并進行圖像采集。

2.5 Western blot測定p-PKCα、PKCα蛋白的表達 提取在位內膜及異位灶組織的總蛋白，測定蛋白濃度后，每組取等量蛋白變性，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白分離后，采用半干轉膜儀將蛋白移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h后，采用相應一抗4℃孵育過夜。次日洗膜后，對應二抗孵育1 h，清洗后用化學發光系統進行凝膠成像。用Image J分析軟件分析蛋白條帶灰度值，以目標蛋白/GAPDH的數值作為統計數據。

3 結果

3.1 各組大鼠異位灶情況觀察 模型組異位灶明顯，體積較大，表面血管豐富，與周圍組織黏連嚴重；與模型組比較，中藥組異位灶體積及血管網隨劑量加大而逐漸減??；西藥組也同樣抑制異位灶的形成。見圖1。

注：A.模型組；B.中藥低劑量組； C.中藥高劑量組；D.西藥組

3.2 各組大鼠異位灶組織形態觀察 HE結果顯示，假手術組子宮內膜結構完整，高柱狀上皮細胞整齊、緊密排列，腺體豐富；模型組異位內膜上皮細胞呈低柱狀或乳頭突起狀，炎性細胞浸潤及血管增生明顯，腺體數量較少；各中藥組和西藥組的異位內膜均可見不同程度的萎縮，上皮細胞不完整，間質細胞小，腺體數目少，腺腔內有少量白細胞。見圖2。

注：A.假手術組；B.模型組異位灶；C.中藥低劑量組異位灶；D.中藥高劑量組異位灶；E.西藥組異位灶

3.3 各組大鼠在位內膜和異位灶中p-PKCα、PKCα蛋白水平的比較 模型組子宮在位內膜p-PKCα的蛋白表達水平高于假手術組(P<0.05)，具有統計學意義；中藥高劑量組和西藥組子宮在位內膜p-PKCα的蛋白表達水平低于模型組(P<0.05)，具有統計學意義，詳見表1。

表1 各組大鼠在位內膜中 PKCα、p-PKCα蛋白相對表達量

中藥高劑量組和西藥組異位灶組織p-PKCα的蛋白表達水平低于模型組(P<0.05)，具有統計學意義，詳見表2。各組大鼠子宮在位內膜和異位灶組織中PKCα的蛋白表達水平均無明顯變化(P>0.05)。詳見表1、表2。

表2 各組大鼠異位灶中 PKCα、p-PKCα 蛋白相對表達量

4 討論

EMs因人和病變部位的不同，臨床表現各異，常表現為疼痛、不孕、月經異常等癥狀，嚴重影響女性的生活品質和健康。內異癥雖然是良性病變，卻具備侵襲、轉移及復發等惡性行為，因其確切發病機制尚不明確，是目前臨床常見的難治性婦科疾病[7]。故對本病發病機制及治療手段的探索己成為婦科領域十分關注的問題。

中醫古籍中并無EMs病名，但依據其臨床表現，歸屬于中醫“痛經”“癥瘕”“不孕”等范疇。中醫學者認為“血瘀”是EMs的病理基礎，眾多醫家從不同角度對EMs“血瘀證”的病機進行了探討和研究，豐富了內異癥的病機學說。瘀血阻于沖任、胞宮，為本病的基本病理特點，“久病及腎”，易致腎虛；臨床常表現為下腹部畏寒喜暖、甚至腰以下冰冷，當屬虛寒。腎陽不足，虛寒內生，寒客胞宮，血與寒凝，瘀血阻于沖任，致使沖任氣血失調，離經之血凝集，而發生內異癥[8]。

近年來，中醫藥治療EMs取得了很多進展。連方等采用祛瘀解毒法[9]，魏郁清等采用補腎序貫結合活血化瘀法[10]，趙瑞華等采用活血化瘀法[11]能明顯改善EMs抑郁焦慮患者臨床癥狀。劉海燕等應用補腎祛瘀法分排卵期前和排卵期后治療EMs不孕，患者妊娠率可得到有效提高[12]。全國名中醫杜惠蘭教授提出補腎溫陽、祛寒化瘀為基本治法，并以此為理論指導，創立補腎溫陽化瘀方應用于臨床多年，臨床療效顯著。對補腎溫陽化瘀方進行臨床研究，發現中藥組患者在生理領域、心理領域、獨立性領域、社會關系領域的評分均優于孕三烯酮對照組，可以明顯改善患者的臨床癥狀及生活品質，臨床總有效率達73.33%～82%，可明顯改善患者痛經、月經不調、經期腰骶痠痛、性交痛、性欲減退、形寒肢冷、神疲乏力等癥狀體征，且無明顯副作用出現[13]。方中炮附子和桑寄生共為君藥，二者共奏補火助陽、散寒止痛、補益肝腎之功；肉桂和狗脊共為臣藥，加強溫陽散寒止痛功效；小茴香、川芎、制沒藥等活血化瘀、理氣止痛，共為佐藥。藥理學研究顯示附子具有抗炎鎮痛作用，對延緩EMs病灶形成及緩解疼痛均具有良好的療效[14]，除此之外，桑寄生中的總黃酮[15]、狗脊的有效成分[16]、川芎的有效成分生物堿類[17]等均具有抗炎、鎮痛作用。補腎溫陽化瘀方可以降低異位內膜的黏附、侵襲、種植能力，抑制血管生成及神經生長、降低細胞自噬、改善乏氧狀態從而抑制內異癥的發展[18-22]。

現代研究認為，EMs的發病機制主要與基于腫瘤特征的侵襲和遷移、細胞增殖及凋亡等密切相關[23]。研究發現，PKC信號通路激活可以刺激血管內皮生長因子(VEGF)、結締組織生長因子(CTGF)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)和白細胞介素-8(IL-8)的基因表達來誘導子宮內膜修復[24]。采用基因芯片分析發現，在EMs基質細胞中PKCβ1表達增高[25]。在炎性痛和神經病理性疼痛模型中，PKC的表達上調[26]，通過瞬時感受器電位香草酸亞型1(TRPV1)通道改變電流，導致痛覺過敏[27]。課題組前期研究發現，補腎溫陽化瘀方能夠激活TRPV1通道[18]，因此我們猜測PKC通路的激活可能與EMs的疼痛癥狀相關。也有大量文獻報道，中醫藥可通過核因子-κB(NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt等多條信號通路改善EMs[28]。而PKC能調控MAPK/細胞外信號調節激酶(ERK)通路癌細胞的增殖與轉移[29]、磷酸化的PKC可磷酸化NF-κB，進而促進炎癥介質如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)等釋放，導致疼痛的發生[30]。此可見PKC信號通路可能多途徑參與EMs的發生。

在本研究中，筆者檢測了各組大鼠在位內膜及異位灶中PKCα、p-PKCα蛋白的表達情況，結果顯示，模型組的p-PKCα蛋白水平顯著升高，經治療后，治療組的p-PKCα蛋白水平均有不同程度下降。綜上所述，筆者認為補腎溫陽化瘀方通過抑制PKC信號通路來治療EMs，可能是通過PKC影響增殖、遷移、疼痛等，但還需進一步研究驗證。