高效液相色譜中流動相的甲醇乙腈比例探討

張智怡，程冬冬，羅少輝*

（1.江西省檢驗檢測認證總院，江西南昌，330052；2.江西省檢驗檢測認證總院檢測認證技術發展研究院，江西南昌，330029）

0 引言

反相液相色譜有機流動相的研究，對高效液相色譜分析領域的發展而言具有非常重要的意義。對將甲醇和乙腈作為流動相的各種比例檢測標準進行實驗研究，以此探究解決高效液相色譜中存在的疑難雜癥的方法，從而提高檢測效率并節約成本。

在實際檢測工作中，我們會同時收到大量樣品，然而參照國標、行標或企標時發現，標準制定者往往沒有考慮到一線檢測人員需要頻繁更換流動相，導致實際工作量巨大的問題。我們通過試驗，試圖統一甲醇和乙腈流動相（體積比）。統一甲醇和乙腈流動相（體積比）不僅能夠大大減輕一線檢測人員的工作負擔，而且對高效液相色譜分析具有積極推廣的意義。

經查閱大量國內外高效液相色譜流動相相關文獻［1-8］，目前只零星發現有甲醇乙腈混合流動相檢測標準，尚未發現通用有機流動相、黃金混合比例的提法。本項目試圖統一反相色譜流動相中的有機相。根據現有的實驗成果，再通過大量試驗數據證明其普遍性、通用性后，很多國標和企標檢測方法將得到修正、補充和參考，這對于分析化學領域和標準制定領域來說具有非常重要的意義。

1 研究內容和目標

1.1 研究內容

本文研究甲醇和乙腈作為流動相配比時的特性。

使用通用有機流動相方法，采用最簡單、基本的高效液相色譜儀對三種常見農藥進行色譜和含量分析。

1.2 研究目標

1.2.1 有機流動相的甲醇乙腈的配比值為3：2 的通用性驗證

通過研究甲醇和乙腈的體積比V甲醇：V乙腈=3：2 標準有機流動相在實際檢測中的通用性，縮短檢測時間，提高檢測效率，節約流動相成本，將出峰異常率降到最低，免去摸索各種適合條件的時間。

1.2.2 有機流動相在農藥檢測中的運用

通過研究甲醇和乙腈的體積比V甲醇：V乙腈=3：2 標準有機流動相在實際檢測中的通用性，用梯度分析法改變流動相比率和檢測波長，建立多種農藥出峰時間，準確得出檢測結果。

1.2.3 有機流動相的拓展運用

通過研究甲醇和乙腈的體積比V甲醇：V乙腈=3：2 標準有機流動相在實際檢測中的通用性，推廣至分析檢測其他應用領域，如化工生產、食品藥品監督、保健品、生物化學研究等。

2 研究方法和技術路線

2.1 甲醇乙腈混合流動相洗脫能力配比分析

參考大量文獻［9-11］，根據研究甲醇乙腈極性及大量實驗數據，本項目統一有機流動相標準為A 體積比（甲醇：乙腈=3：2），以下簡稱A 體積比（通用），甲醇大致相當于89%乙腈的洗脫能力，故以此比例換算純甲醇或純乙腈作為有機流動相檢測標準。

例：①當檢測標準為體積比A（甲醇）：B（水）=80：20 時，我們用通用有機流動相換算公式體積比 A（通用）=［0.4A（甲醇）］×89%+0.6A（甲醇）=0.956A（甲醇），采用本項目通用有機流動相后的有機相體積比A（通用）：B（水）=76.48：23.52 ≈76.5：23.5。

②當檢測標準為體積比A（乙腈）：B（水）=80：20時我們用通用有機流動相換算公式體積比A 通用=0.4A（乙腈）+［0.6A（乙腈）］ ÷89%=1.074A 乙腈，修正后體積比A（通用）：B（水）=85.92：14.08 ≈86：14；當分離情況不佳時，可根據檢測儀器和色譜柱特性適當調低有機流動相比例。

2.2 混合流動相在農藥檢測中的運用

選出幾種具有代表性的三種農藥產品噻呋酰胺、噻蟲·吡蚜酮和嘧菌酯進行試驗。

2.3 混合流動相在國標等方面的運用拓展前景

用通用有機流動相對上述農藥國標（行標、企標）檢測方法進行修正后，將兩種方法檢測結果進行比對。

2.4 混合流動相的準確性、通用性驗證

基于通用有機流動相，采用梯度法對上述部分農藥混合標樣進行檢測，包括漸變流動相比例和檢測波長，建立各組分出峰時間表和DAD 數據庫，通過大量數據來證明V甲醇：V乙腈=3：2 的通用有機流動相液相色譜分離法的準確性和通用性。

3 試驗部分

3.1 試驗條件

Agilent 1200 高效液相色譜儀（具可變波長紫外檢測器）；250×4.6 mm（i.d.）色譜柱；不銹鋼柱（內裝Tc-C18 填料）；流速1 mL/min；進樣體積20μL。

3.2 混合流動相運用在噻呋酰胺的檢測

在企業標準實驗條件下（檢測波長225 nm）檢測混配懸浮劑（噻呋酰胺溶度約0.1 g/L ，己唑醇溶度約0.03 g/L 的甲醇混合溶液）時，噻呋酰胺出峰時間在7.087 min，己唑醇出峰時間在11.740 min，但保留時間在2.420 min 時出現了噻呋酰胺鼓峰問題（見圖1），這可能是由于流動相（甲醇：水=75：25）的種類和組成比造成的。而經試驗改用優化后的通用有機流動相（有機相：水=70：30，有機相為V甲醇：V乙腈=3：2 混合溶劑）能解決此問題（見圖2），噻呋酰胺出峰時間在9.968 min，己唑醇出峰時間在14.474 min，噻呋酰胺鼓峰幾乎消失（可忽略不計），并且提高了檢測精密度。對比圖1 和圖2，發現在其他試驗條件不變的情況下，僅改變流動相的種類和組成，可以修正噻呋·己唑醇典型色譜圖的前鼓峰問題。

圖1 企業標準實驗條件下φ（甲醇：水）=75：25 檢測噻呋·己唑醇標準樣品典型色譜圖

圖2 通用有機流動相實驗條件下φ：（有機相：水）=70：30 檢測噻呋·己唑醇標準樣品典型色譜圖

3.3 混合流動相在檢測噻蟲·吡蚜酮的運用

采用國標法（檢測波長265 nm）檢測噻蟲·吡蚜酮（噻蟲嗪和吡蚜酮溶度均約0.1 g/L 乙腈水混合溶液）時，以φ（乙腈：水）=10：90（水為0.2 g/L 磷酸二氫鉀溶液）為流動相，吡蚜酮的保留時間為4.244 min，噻蟲嗪的保留時間在7.955 min，但色譜圖會出現三叉鬼峰（見圖3），這可能與流動相的極性有關，也可能是樣品預處理時發生了降解。而采用本項目通用有機流動相后，吡蚜酮的保留時間為13.155 min，噻蟲嗪的保留時間在17.742 min（見圖4），盡管保留時間有所延長，但能有效地將噻蟲嗪和吡蚜酮徹底分離，消除多余雜峰，并且成功解決了三叉鬼峰問題，計算結果也能控制標準范圍內。

圖3 采用國標法實驗條件下：流動相φ（乙腈：水）=10：90（水為0.2g/L 磷酸二氫鉀溶液）檢測噻蟲·吡蚜酮標準溶液時鬼峰色譜圖

圖4 采用通用有機流動相φ（有機相：水）=18：82（有機相為甲醇和乙腈3：2 混合溶劑，水為0.2 g/L 磷酸二氫鉀溶液）檢測噻蟲·吡蚜酮標準溶液時典型色譜圖

3.4 混合流動相在檢測嘧菌酯水分散粒劑中的運用

采用《嘧菌酯水分散粒劑》（HG/T 4931—2016）檢測25%嘧菌酯（嘧菌酯約0.1 g/L 乙腈水混合溶液），以φ（乙腈：水）=45：55（水為pH=2.5 的磷酸水溶液）為流動相，嘧菌酯在19.183 min 出峰，同時出現一雜峰且拖尾（見圖5），嚴重影響了目標物質的分離度、靈敏度和定量。造成這種現象的原因可能是樣品中含有其他未知化合物。而采用本項目通用有機流動相，并調整流動相有機溶劑與水的體積比后，嘧菌酯保留時間在23.066 min（見圖6），嘧菌酯主峰與拖尾雜峰分離，所得結果較行標法更為精確。

圖5 采用行標HG/T 4931-2016：φ（乙腈：水）=45：55（pH=2.5磷酸水溶液）檢測嘧菌酯試樣典型色譜圖

圖6 采用通用有機流動相φ（有機相：水）=50：50（pH=2.5 磷酸水溶液）檢測嘧菌酯試樣典型色譜圖

3.5 混合流動相在檢測24 種非法添加農藥運用

對國標方法中流動相的組分和體積比進行條件試驗（流量1.0 mL·min-1，最大壓力400.0 bar），通過調整甲醇和乙腈的體積比進行混合標樣梯度法試驗（見表1），建立24 種高頻非法添加農藥（24 種標樣含量均為約0.04g/L 甲醇水混合溶液）色譜圖（見圖7~10）。對比圖7~10 結果，圖9 分離效果最好，拖尾峰最少，重峰最少。24 種農藥在通用有機流動相（V甲醇：V乙腈=3：2）出峰順序（圖9 所示）：6.536 min 甲胺磷；8.305 min 乙酰甲胺磷；14.195 min 吡蚜酮；15.391 min 滅多威；16.018 min烯啶蟲胺；17.954 min 噻蟲嗪；21.550 min 吡蟲啉；24.124 min 啶蟲脒；32.332 min 克百威；33.290 min 福美雙；39.755 min 氯蟲苯甲酰胺；43.540 min 毒死蜱；47.386 min 氟蟲腈；51.368 min 辛硫磷；54.883 min氟鈴脲；57.570 min 溴蟲腈；59.765 min 唑蟲酰胺；62.696 min 虱螨脲；70.418 min 丁醚脲；72.380 min 螺螨酯；78.455 min 阿維菌素；79.120 min 聯苯菊酯；84.357 min 氟蟲脲；92.740 min 丁硫克百威。

表1 A（有機相）：B（水）流動相洗脫梯度

圖7 梯度法甲醇-水的24 種農藥混合標樣色譜圖

圖8 梯度法乙腈-水24 種農藥混合標樣色譜圖

圖9 梯度法有機相（V甲醇：V乙腈=3：2）-水24 種農藥混合標樣色譜圖

圖10 梯度法有機相（V 甲醇：V 乙腈=8：2）-水24 種農藥混合標樣色譜圖

3.6 實驗綜述

對嘧菌酯、噻蟲·吡蚜酮、噻呋·己唑醇三種農藥樣品采用國標法、企標法和行標法進行檢測的時間與本項目通用有機流動相檢測時間進行對比，最終統計出國標法和企標法為12 小時左右，通用有機流動相方法為6小時左右，其中國標法和企標法消耗的大量時間集中在更換流動相時的洗柱時間，并且檢測噻蟲·吡蚜酮時條件不適合，摸索條件浪費了大量時間。由此可知，本次試驗優化的通用有機流動相（V甲醇：V乙腈=3：2）對于提高上述三種典型農藥有效成分、食品農藥殘留、農藥隱性添加成分的檢測效率有明顯作用。

4 結論

本文以高效液相色譜法中流動相甲醇和乙腈的比值，從通用有機流動相的角度，建立一個完善的黃金有機流動相（V甲醇：V乙腈=3：2）檢測標準體系，對國標（行標、企標）起到修正、參考、補充作用。甲醇乙腈黃金配比有機流動相能大大提高檢測效率和檢測準確度，降低檢測成本，用在復雜組分梯度法定性時，還降低了檢測門檻。因此，甲醇乙腈黃金配比有機流動相的實用前景非常廣闊。而專注于研究檢測方法的通用性，對于分析化學液相色譜儀器檢測領域研究具有重要的實際意義。