中國科學技術大學在基因敲入供體的優化方面獲進展

中國科學技術大學合肥微尺度物質科學國家研究中心、化學與材料科學學院教授梁好均與生命科學與醫學部研究員鮑堅強合作，針對目前基因敲入供體的低效率、高成本等問題，優化并提出了一種新型的功能核酸供體，提高了基因敲入的效率。5月22日，相關研究成果以Efficient precise integration of large DNA sequences with 3'-overhang ds-DNA donors using CRISPR/Cas9為題，通過直投方式發表在《美國國家科學院院刊》（PNAS）上。

CRISPR技術改變了我們操縱基因組進行研究和基因治療的能力，使用帶有同源臂的外源供體作為模板依賴同源介導修復（HDR）途徑來精確敲入基因。然而，對于基因大小的DNA供體模板，HDR途徑較為低效。目前，可采用在ssDNA或dsDNA供體末端引入化學修飾以增強供體穩定性，供體共價連接到CRISPR系統上提高切割位點局部濃度等方法提高基因敲入效率。然而，這些方法具有操作困難、成本高等問題。亟需進一步優化基因敲入的供體，以促進CRISPR/Cas9介導的基因大小的敲入在生命科學和臨床治療中的應用。

鑒于此，梁好均課題組深入調研ssDNA和dsDNA作為供體的敲入機理，結合課題組在核酸化學領域的經驗，在單個供體中整合ssDNA和dsDNA的獨特優勢，設計并提出了一種具有3'懸突的dsDNA結構（odsDNA），并將其作為供體實現CRISPR/Cas9介導的大片段基因敲入（LOCK）。

本工作是梁好均課題組繼dsDNA供體5'末端化學修飾提高基因敲入效率和RNA介導的CRISPR-dCas9轉錄調控系統之后，在基因編輯方向的又一重大突破。該研究提出了一種經濟普適的方法來制備任意3'懸突長度的ods-DNA供體，利用鏈中帶有連續五個硫代磷酸酯（phosphorothioate）修飾的引物通過PCR擴增目的基因序列，再通過Lambda核酸外切酶消化處理，得到具有3'懸突的odsDNA。研究通過比較基因大?。?.1kb和2.5kb）的DNA供體的敲入效率，發現odsDNA顯著提高了靶向精確敲入效率，且與通用的dsDNA供體相比最高可提高4.3倍，同時在許多哺乳動物細胞跨多個基因組位點中保持了較低的插入缺失率和脫靶事件。當利用3'單鏈懸臂與偶聯技術結合時，使用odsDNA供體的敲入效率比dsDNA供體提高5.2倍。該LOCK策略在基因敲入中具有優勢，有望在未來取代ssDNA或dsDNA供體，實現其他策略無法完成的大片段基因敲入。

研究工作得到科學技術部和國家自然科學基金的支持。

（文章來源：中國科學院網站）