膠原/氧化葡聚糖/葡萄糖酸鋅載藥水凝膠的制備及性能

朱 志 勉, 匡 衛, 田 薈 琳, 段 煉

( 1.齊魯工業大學(山東省科學院) 輕工學部, 山東 濟南 250353;2.齊魯工業大學 生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室, 山東 濟南 250353;3.西南大學 蠶桑紡織與生物質科學學院, 重慶 400715 )

0 引 言

基于天然高分子材料,如I型膠原[1]、葡聚糖[2]、殼聚糖[3]等,制備的水凝膠,由于其結構和組成與細胞外基質相似,生物學性能較好,廣泛應用于組織工程支架[4]、藥物遞送載體[5]等生物醫學領域。

I型膠原作為細胞外基質中重要的結構蛋白,得益于其獨特的四級結構,具備其他蛋白無法媲美的優異生物相容性、生物降解性和低細胞毒性等生物學特性,已廣泛應用于生物醫學和化妝品等領域。在體外適宜的條件下(生理條件最佳),I型膠原分子可以通過自組裝行為生成具有D周期結構的成熟膠原纖維[6],進而形成膠原水凝膠。然而純膠原水凝膠力學性能和抗酶降解能力較差,故會限制其在生物醫學領域的應用。為彌補此缺陷,可引入外源性組分對膠原進行物理或化學改性。物理改性一般有改善程度不足的缺陷;化學改性雖可顯著提高純膠原水凝膠的機械性能,但需注意改性膠原材料的生物相容性和降解性問題。因此引入無害且具備功能化的動態化學鍵,如席夫堿鍵[7]和雙硫鍵[8]等,來制備環境刺激響應型水凝膠已成為膠原材料改性的新方向。席夫堿反應由于實驗方法簡單、反應迅速且具備一定的自愈性能已廣泛用于制備細菌響應型水凝膠,可有效解決傳統水凝膠對細菌感染環境的可控藥物釋放能力不足的問題。

因天然多糖來源廣泛,生物學特性較優異,目前基于雙醛基化多糖向膠原基生物材料中引入動態席夫堿鍵的研究相對較多。葡聚糖作為一種電中性多糖,可與帶正電荷的膠原分子通過氫鍵形成均一穩定的體系,避免了由于靜電相互作用產生的膠原凝聚沉降現象[9]。此外,葡聚糖的葡萄糖單元中的鄰位羥基可被高碘酸鹽氧化生成醛基,故醛基化葡聚糖可和膠原分子側鏈的自由氨基發生席夫堿反應而顯著提高膠原基生物材料的機械性能,且不會影響其生物學性能[10]。

除側鏈自由氨基外,膠原分子側鏈還富有可供交聯的羧基基團,故可通過金屬離子與膠原側鏈羧基的配位改性改善膠原基生物材料的機械性能[11]。葡萄糖酸鋅作為一種常見的營養強化劑,具有一定的抗菌性能和優異的生物學性能[12],故推測可利用葡萄糖酸鋅中富含的Zn2+與膠原側鏈的羧基配位來進一步加強膠原水凝膠的機械強度,且賦予改性膠原水凝膠抑菌性能。

本實驗旨在開發一種用于遞送氨基糖苷類藥物的細菌響應型膠原基水凝膠。通過溶脹性、抗酶解性、動態流變和SEM測試對水凝膠的機械性能和結構進行分析,通過阿米卡星釋放動力學測試研究水凝膠的細菌響應性釋藥性能,通過水凝膠對細菌生長的抑制效果研究其抗菌性能。

1 實 驗

1.1 原料及試劑

I型膠原蛋白,實驗室自制;葡聚糖T70,上海金穗生物科技有限公司;阿米卡星,北京索萊寶科技有限公司;乙二醇、無水乙醇、甲醇、醋酸,天津市富宇精細化工有限公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀,國藥集團化學試劑有限公司;高碘酸鈉、叔丁醇、硼酸,天津市大茂化學試劑廠;I型膠原酶,北京智杰方遠科技有限公司;氯化鈉,天津市鼎盛鑫化工有限公司;固體LB Broth,青島生工生物科技有限公司;葡萄糖酸鋅、戊二醛、鄰苯二甲醛、3-巰基乙酸,上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2 材料制備

1.2.1 氧化葡聚糖(ODex)的制備

稱取一定量葡聚糖溶于水配制質量分數2.0%的葡聚糖溶液;根據氧化度100%(OD 100%)計算高碘酸鈉用量,避光稱取,用去離子水溶解后加到葡聚糖溶液中,避光攪拌反應24 h,加入2 mL乙二醇攪拌2 h終止反應[10]。透析2 d后冷凍干燥得到ODex海綿,避光密封保存。

1.2.2 膠原/氧化葡聚糖/葡萄糖酸鋅水凝膠(CODZnG)的制備

冰浴條件下將凍干膠原海綿溶解于0.005 mol/L的醋酸溶液中,制得質量濃度10 mg/mL的膠原溶液;將凍干的ODex海綿溶于PBS(0.02 mol/L,pH 7.4)中,根據膠原與氧化葡聚糖質量比20∶1、10∶1、4∶1、1∶1,配制不同質量分數的OD 100% ODex溶液。

將葡萄糖酸鋅水溶液加入膠原溶液中混合均勻,加入ODex溶液,渦旋下滴加NaOH溶液將樣品pH調至8.5,37℃水浴中反應2 h即得CODZnG。最終水凝膠樣品中膠原質量濃度為5 mg/mL,葡萄糖酸鋅質量濃度為0.05 mg/mL。

根據水凝膠中ODex比例將純膠原水凝膠和CODZnG命名為Col、CODZnG-0.05、CODZnG-0.1、CODZnG-0.25、CODZnG-1。

1.2.3 載藥水凝膠(CODZnG-AMK)的制備

以CODZnG-1為載藥水凝膠基質。先將阿米卡星加入ODex溶液中預交聯,隨后將其加入膠原/葡萄糖酸鋅溶液中混合均勻,調整pH為8.5并在37℃水浴2 h成膠,記為水凝膠CODZnG-AMKI,其中膠原質量濃度為5 mg/mL,阿米卡星質量濃度為1 mg/mL。

同樣操作制備阿米卡星質量濃度為2 mg/mL的載藥水凝膠,記為CODZnG-AMKII。

1.3 CODZnG水凝膠性能表征

1.3.1 溶脹性能測試

CODZnG水凝膠樣品真空冷凍干燥,稱重,記為m0。室溫下將其浸沒于PBS(0.01 mol/L,pH 7.4)中,每間隔一定時間后取出,用濾紙擦拭樣品表面多余液體后稱重,記為m1,直至樣品質量溶脹平衡。每個樣品稱重3次取平均值,每組3個樣品。

溶脹率=[(m1-m0)/m0]×100%

式中:m0為樣品初始質量,m1為樣品溶脹后質量。

1.3.2 抗酶降解性能測試

將1 mL不同改性膠原水凝膠表面擦干后稱重,記為m2。將其浸泡于3 mL、100 μg/mL的膠原酶溶液中,保持37 ℃水浴,于固定時間點取出樣品后輕擦干表面稱重,記為m3。

降解率=[(m2-m3)/m2]×100%

式中:m2為樣品的初始質量,m3為樣品降解后的質量。

1.3.3 機械流變測試

采用流變儀(TA,ARES-G2)對CODZnG水凝膠樣品進行黏彈性能測試。使用平板模式(板直徑25 mm,板間距1 mm),在動態測試中選擇控制應力,分別測定彈性模量(G′)、黏性模量(G″)和損耗因子(tanδ)隨剪切頻率的變化。測試溫度為20 ℃,應變為5%,動態頻率為0.1～10 Hz。

1.3.4 抗壓縮性能測試

按“1.2.2”操作制備Col和CODZnG-1。水凝膠樣品直徑為10 mm,高度為5 mm。采用質構儀(TA,XT Plusc)測試,壓縮速率為1 mm/s,直到水凝膠被壓破停止測試。

1.3.5 掃描電鏡測試(SEM)

室溫下將Col和CODZnG-1水凝膠樣品在體積分數為2%的戊二醛水溶液中固定2 d,用乙醇溶液(30%,50%,70%,80%,90%,95%,99.5%,100%)梯度脫水,再用叔丁醇置換殘余的乙醇,最后將樣品冷凍干燥。

將CODZnG凍干海綿表面進行真空噴金處理后進行電鏡掃描,加速電壓20 kV。

1.3.6 阿米卡星釋放動力學測試

采用鄰苯二醛衍生化法[13]測定阿米卡星的釋放量。鄰苯二醛衍生化試劑配制過程:將268 mg鄰苯二醛溶于10.00 mL甲醇中,再加入1.40 mL 3-巰基乙酸和38.60 mL硼酸,用KOH調節pH至10.5。

阿米卡星標準曲線實驗過程:依次配制質量分數為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL的阿米卡星水溶液。將1 200 μL鄰苯二醛衍生液加入600 μL阿米卡星標準溶液中,補充PBS至體積3 mL。室溫孵育30 min后測試333 nm處的吸光度。

標準曲線:y=-1.427 6×10-4+0.896 2x,R2=0.999。其中x為阿米卡星質量濃度,mg/mL;y為樣品在333 nm處的吸光度。

阿米卡星釋放動力學測試過程:室溫下將2 mL CODZnG-AMK浸泡于5 mL pH 7.4或5.0的PBS中,每隔規定的時間取出600 μL樣品進行測試,取樣后補充600 μL對應pH的PBS以保持總體積不變。

將1 200 μL鄰苯二醛衍生化液加到所取樣品中,再補充對應pH的PBS至3 mL。室溫孵育30 min后,測試333 nm處吸光度。根據標準曲線計算得到不同時間段的阿米卡星釋放率。

1.3.7 抗菌性能測試

根據細菌生長曲線的差異來反應改性膠原水凝膠的抗菌性能。將固體LB Broth溶解為肉湯培養基,高溫滅菌2 h,加入水凝膠樣品和少量大腸桿菌或金黃色葡萄球菌,在恒溫振蕩培養箱中培養細菌。通過測定溶液于600 nm的吸光度變化來反應細菌的生長情況。

2 結果與討論

2.1 水凝膠的溶脹性能

溶脹性能是評估水凝膠在水性體系中穩定性的一個重要指標。用于傷口敷料的水凝膠需要具備強大的溶脹性能,從而確保能在短時間內吸收大量傷口滲出液[14]。載藥水凝膠則不同,過強的溶脹會導致水凝膠在進入體內釋放藥物前迅速膨脹[5],擠壓組織的同時可能會影響藥物的釋放效果,故需合理控制載藥水凝膠的溶脹率。

純膠原水凝膠和CODZnG的溶脹性能見圖1。由圖1可知,純膠原水凝膠的平衡溶脹率高達719%,CODZnG-0.05、CODZnG-0.1、CODZnG-0.25和CODZnG-1水凝膠平衡溶脹率依次降為606%、498%、422%和313%。所有的水凝膠樣品均能在2 h內達到溶脹平衡,但樣品間的平衡溶脹率差別卻很大,CODZnG的平衡溶脹率隨著ODex量的增加而顯著降低。因膠原分子中含有大量的親水性基團,如酰胺基、羧基、氨基等,使純膠原水凝膠具有良好的親水性;純膠原纖維水凝膠網狀結構穩定性較差,故其平衡溶脹率最高。ODex和葡萄糖酸鋅交聯改性后膠原水凝膠的平衡溶脹率大大降低,這可能是因為交聯提升了CODZnG網狀結構的穩定性。故推測CODZnG可滿足載藥水凝膠對溶脹率的需求。

圖1 純膠原水凝膠和CODZnG的溶脹性能

2.2 水凝膠的體外酶降解性能

水凝膠的抗酶解性能對其生物學性能影響很大。純膠原水凝膠因其網狀結構穩定性較差,易被膠原酶快速降解而導致水凝膠骨架坍塌,失去其促進細胞增殖和藥物緩釋等優良生物學性能的持久性[15]。對膠原進行交聯改性來提高其抗酶解能力是一種常見的方法。交聯改性對膠原水凝膠體外酶降解性能的影響見圖2。由圖2可知,與純膠原水凝膠相比,改性水凝膠的體外酶降解速率大大降低,CODZnG抗酶解性能的提升幅度與ODex量正相關。這進一步證明ODex化學交聯和Zn2+配位協同作用使得CODZnG的網狀結構更加穩固,與溶脹性能測試結果一致。

圖2 純膠原水凝膠和CODZnG的抗酶降解性能

2.3 CODZnG水凝膠力學性能

為進一步評估交聯改性對CODZnG結構穩定性的影響,對純膠原水凝膠CODZnG進行動態流變性能測試,結果見圖3和表1。由圖3可知,純膠原水凝膠和CODZnG水凝膠均呈現出非線性黏彈性特性,即在0.1～10 Hz的剪切范圍內,G′基本保持不變,且G′>G′′,表現出水凝膠典型的黏彈性行為[16]。由表1可知,與純膠原水凝膠相比,CODZnG水凝膠的G′顯著提高。CODZnG-0.05的G′從24.2 Pa升至77.9 Pa;繼續增加ODex量至質量比為10∶1時,CODZnG-0.1的G′升至292.6 Pa;繼續增大ODex量至膠原與ODex質量比為1∶1時,CODZnG-1的G′達到552.7 Pa,說明經過ODex化學交聯和Zn2+配位協同作用,膠原分子鏈段之間產生了更多的纏結,因而形成了更加堅固的交聯網狀結構,從而提升了CODZnG水凝膠的彈性抗變形能力。此外,CODZnG-0.1、CODZnG-0.25和CODZnG-1的tanδ基本相同,表明這三種水凝膠的彈性相當。綜合溶脹性能、抗酶解性能機械流變結果,且為保證制備載藥水凝膠時ODex有足夠的活性醛基,故考慮CODZnG-1作載藥水凝膠基質。

表1 水凝膠的流變性能

圖3 CODZnG水凝膠的流變性能

由抗壓測試可知,CODZnG-1的斷裂抗壓強度達5.21 kPa,與純膠原水凝膠1.6 kPa的強度相比大大提升,進一步說明CODZnG-1的機械強度可滿足載藥水凝膠的制備要求。

2.4 SEM

纖維編織網狀結構是膠原水凝膠的重要特點,該結構作為膠原水凝膠的骨架,對材料穩定性起決定性作用;用作支架材料時,網狀結構可為細胞黏附、增長提供適宜的空間[17];用作傷口敷料傳遞藥物時,網狀結構可吸收組織滲出液。因此,制備水凝膠材料時需結合微觀形貌觀察來初步判斷應用性能。

圖4為純膠原水凝膠和CODZnG-1的SEM圖像。兩種水凝膠均呈現出由膠原纖維編織所形成的三維網狀結構,纖維與纖維編織所形成的孔徑通道結構既有利于液體的儲存從而帶來一定的溶脹性能,作載藥應用時也可以為藥物提供嵌入的空間[5]。從圖4(a)可以看出,純膠原水凝膠通過自組裝形成的膠原纖維纖細,纖維編織所形成的網狀結構較致密。圖4(b)中的改性膠原水凝膠的膠原纖維則比較粗壯,纖維與纖維間形成的橫向聚集較多,網狀結構的孔徑相對較大。這表明ODex和葡萄糖酸鋅的協同交聯可能先促進膠原分子形成大的聚集態,再通過自組裝形成更粗壯的成熟膠原纖維,因而賦予CODZnG-1更好的力學性能。ODex可能在成熟膠原纖維束之間交聯,帶入空間位阻的同時也促進膠原纖維之間的橫向聚集,既改善了水凝膠的力學性能,又使網狀結構的孔徑增大。這意味著改性膠原水凝膠不僅可以為細胞的黏附增殖或藥物儲存提供更堅固的支架,還可以提供更通暢的營養運輸和藥物釋放通道。

(a) 膠原水凝膠(×5 000)

2.5 阿米卡星的pH響應釋放

細菌在呼吸和發酵過程中會產生酸性產物,如碳酸和乳酸,故生物體被細菌感染后會產生pH 5左右的弱酸環境[5]。根據這種特定的變化,利用席夫堿鍵來實現氨基糖苷類藥物的細菌響應釋放效果。阿米卡星是一種常見的氨基糖苷類抗生素,具有臨床上的廣譜抗菌活性,因此在本研究中選擇阿米卡星作為藥物模型。因高劑量的氨基糖苷類抗生素具有嚴重的耳毒性和腎毒性[13],低劑量則會失去良好的抗菌效果,故需一種可根據細菌感染情況按需給藥的智能水凝膠。

設置pH 7.4和pH 5.0兩種pH,分別對應體內健康環境和細菌感染后的環境;考慮到傷口各異所需抗菌藥量不同,設置1和2 mg/mL兩種阿米卡星質量濃度。由圖5可知,純膠原水凝膠在兩種pH下的阿米卡星釋放率差異較小,24 h時pH 7.4阿米卡星的釋放率為50.9%,pH 5.0時阿米卡星的釋放率為64.4%,表明純膠原水凝膠中藥物的釋放可能為普通的擴散釋放,對細菌感染的響應性低。而CODZnG-AMKI在兩種pH下的阿米卡星釋放率有明顯差異,24 h時pH 7.4阿米卡星的釋放率僅為15.9%,而pH 5.0時阿米卡星的釋放率增大至77.0%,表明CODZnG-AMKI可減緩健康體況時阿米卡星的釋放,而遭遇細菌感染則可加快阿米卡星釋放,初步實現阿米卡星的可控釋放。此外,CODZnG-AMKII在兩種pH下的阿米卡星釋放率差異更大,24 h時pH 7.4時阿米卡星的釋放率僅為18.8%,而pH 5.0時阿米卡星的釋放率高達83.2%,這表明增大阿米卡星濃度可使CODZnG-AMKII的細菌性響應性增強,實際應用中可根據傷患處具體情況調整阿米卡星濃度來調節其釋放行為[18]。

圖5 pH 5.0與pH 7.4下水凝膠的藥物釋放率

CODZnG-AMK中阿米卡星的結合源于其氨基與ODex的醛基間的席夫堿反應,后進一步穩固于膠原自組裝和ODex與葡萄糖酸鋅的協同交聯所形成的網狀結構中。pH 7.4時,因固定阿米卡星的席夫堿鍵可較穩定存在,僅未交聯固定的少量阿米卡星擴散釋放至水凝膠外。此外,CODZnG中水凝膠孔徑較大,也利于阿米卡星未交聯部分的擴散釋放;因環境較健康,少量阿米卡星即可實現抗菌效果。pH降至5.0時,固定阿米卡星的席夫堿鍵易斷裂[19],交聯固定的阿米卡星開始快速大量釋放,滿足此時強大的抗菌需求。這表明CODZnG-AMK初步具備阿米卡星的細菌型智能響應特性。

2.6 水凝膠抗菌性能分析

蛋白質材料由于其高親水性和其營養物質特性而易被環境微生物污染,因此需添加抗生素[13]或金屬顆粒[20]改善其抗菌性。在CODZnG-AMK中,Zn2+和阿米卡星共同賦予水凝膠抗菌作用,故CODZnG-AMK在阿米卡星釋放前后及釋放期間均具有一定的抗菌效果。將水凝膠浸泡在菌液中,根據兩種常見細菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌)的生長曲線判斷水凝膠對細菌生長的抑制情況,結果見圖6。由圖6可知,純膠原水凝膠對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌兩種細菌的生長沒有抑制作用,均可在前12 h快速增殖,其中金黃色葡萄球菌的生長速度快于大腸桿菌。與純膠原水凝膠相比,CODZnG-1中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長速率明顯減緩,最終平衡濁度值也有所降低,表明CODZnG-1中少量的葡萄糖酸鋅對兩種細菌的生長具有一定的抑制作用,賦予CODZnG-1一定的抑菌效果。加入阿米卡星后,水凝膠中濁度幾乎沒有變化,表明負載阿米卡星可顯著提高抗菌性。

圖6 不同凝膠浸泡液中的大腸桿菌和金黃色

3 結 論

ODex和葡萄糖酸鋅協同交聯作用可顯著改善膠原基水凝膠溶脹性能、抗酶解性能和力學性能,改善程度與ODex量正相關。CODZnG-AMK初步具備阿米卡星的細菌響應性可控釋放能力。CODZnG-1對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有一定的抑菌效果。CODZnG-AMK對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌可持續抑菌。