海藻寡糖的化學法降解制備技術研究進展

孫 林, 宋 宛 霖, 鐘 志 海, 劉 正 一

( 1.中國科學院 煙臺海岸帶研究所, 山東 煙臺 264003;2.中國科學院 海洋大科學研究中心, 山東 青島 266071 )

0 引 言

海藻是一類低等水生孢子植物,富含海藻多糖[1]。海藻多糖就來源可分為褐藻多糖、紅藻多糖和綠藻多糖三大類,具有多種生物活性[2-3]。海藻多糖分子質量較大、溶解度低、生物利用度低,因此在醫學、材料等方面的利用效率也較低,在應用方面受到很大限制[4]。

海藻寡糖是來自海藻細胞壁中海藻多糖的降解產物[5],是聚合度在2～10的直鏈或支鏈化合物。海藻寡糖的組成各不相同,例如瓊膠寡糖由瓊二糖為重復單位連接而成;褐藻膠寡糖由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸通過β-1,4-糖苷鍵連接而成[6]。相較于海藻多糖,海藻寡糖具有溶解度高、分子質量低的特點,分子質量通常小于2 000 u。海藻寡糖具有多種生物活性,如保護細胞結構[7]、抗氧化[8]、促生長[9-11]、誘導植物抗逆性[12-13]、產品保鮮[14-15]等,在農業[16-18]、醫藥[19-20]、食品[21]、化工[22]等領域具有獨特的應用優勢。對海藻寡糖的深度開發利用已成為當前海洋生物資源高值化應用的重要發展趨勢[6](圖1)。例如,當前海藻寡糖的高純標準品產量低且價格高昂,每10 mg售價高達數百美元。如何降低生產成本,突破生產工藝,實現大規模制備高純寡糖是目前海藻寡糖產業化研究的重點。

圖1 海藻寡糖的應用

海藻寡糖因其優良的生物學活性受到越來越多的關注,但當前海藻多糖的降解制備工藝仍有較多局限性、成本較高等缺點,限制了寡糖的生產效率。深入研究開發新的制備工藝對于高值化、高質化利用海藻多糖為代表的海洋生物資源具有重要意義[23]。常用的海藻寡糖制備方法(表1)主要包括物理制備法、化學制備法和酶制備法[24]。物理制備法存在反應機理不明確、重復性不高,酶制備法存在成本較高、效率較低等不足[25],而化學法的效率高且成本低,因此是目前最成熟的海藻寡糖產業化模式。

表1 海藻寡糖3種制備方法的比較

海藻寡糖的種類有多種,其中,褐藻膠寡糖(Alginate oligosaccharides,AOS)、巖藻寡糖(Fucoidan oligosaccharides,FOS)、瓊膠寡糖(Agar oligosaccharides,AGOS)、卡拉膠寡糖(Carrag-eenan oligosaccharides,COS)和滸苔寡糖(Enteromorpha oligosaccharides,EOS)等5種寡糖是褐藻、紅藻、綠藻等海藻寡糖的主要組成部分。本文論述這5種代表性的海藻寡糖的化學法制備技術,以此介紹海藻寡糖的化學法制備技術共性和特殊點。

1 褐藻膠寡糖(AOS)

褐藻膠寡糖是褐藻膠的降解產物,具有溶解性好、分子質量小、穩定性強、易被機體吸收且安全性高等特點[25]?；瘜W法制備褐藻膠寡糖包括光化學法、水熱法、亞臨界熱解法、酸水解法、堿水解法、氧化還原法和有機合成法等方法(表2)。

表2 褐藻膠寡糖的化學制備法

表2所列方法中,光化學降解通過隨機破壞褐藻酸鈉的糖苷鍵進行;水熱法降解則是先釋放甘露糖醛酸(M),選擇性斷裂M-M糖苷鍵;亞臨界熱解法中,海藻酸鹽中的鍵通過β-消除反應選擇性地斷裂,隨著進一步水熱分解,單體亞基中的C—C或C—O鍵斷裂。氧化還原法降解機理:糖苷氧化產生共軛酸質子,共軛酸形成的非還原末端與碳-氧钅翁離子發生斷裂,水分子加入碳-氧钅翁離子中形成還原末端,最終形成由G、M單糖構成的聚合度不等的寡糖[28]。

最常用的褐藻膠寡糖生產方法是酸水解法,使用的酸包括鹽酸、草酸、甲酸和硫酸等[28]。由于海藻酸鹽的耐酸性,海藻酸鹽不能被無機酸完全降解。用多種酸綜合水解海藻酸鹽,與傳統的酸水解法相比具有清潔、快速、產物產率高等特點。此外,還可以應用合成子組裝從非還原端到還原端的糖鏈,以較高的選擇性制備G-連接的寡糖,但反應需要多重的基團保護、去保護步驟,且只能合成聚合度小的寡糖,產量低[29]。

化學降解制備法所用化學試劑反應較劇烈,因此得到的產物都有活性較低的缺點。物理法與酶法制備得到的產物活性相對更高,但反應效率較低且成本較高。

實際生產的過程中通常采用多種方法結合應用,以提高生產效率和生產質量。例如,通過γ射線、H2O2、電離輻射和H2O2的組合處理,可以得到多種分子質量不同的低聚糖。相對于僅通過γ射線產生的低聚糖,這一方法將所需的射線劑量減少了90%[30]。在褐藻膠寡糖的生產中可以多種方法結合使用,以達到取長補短、提質增效的效果。

2 巖藻寡糖(FOS)

巖藻多糖多存在于褐藻中,是一種結合有硫酸基團的水溶性多糖,主要由巖藻吡喃環以α-1,3-糖苷鍵連接而成,同時夾雜著木糖、半乳糖、葡萄糖醛酸等糖類[31]。與巖藻多糖相比,巖藻寡糖因水溶性好、易被機體吸收利用、具有多種生物活性等優點,近年來更受人關注。

表3所列方法中,H2O2在氧化反應體系中產生羥自由基,羥自由基使巖藻多糖發生分子內的重排,進而斷裂β-1,4-糖苷鍵,產生分子質量較小的低聚糖。酸水解法等的原理為采用酸性物質斷裂糖苷鍵進而產生分子質量較小的低聚糖。此外,還有物理法和酶法降解。物理法降解包括超聲波降解法或γ射線輻照制備巖藻寡糖。海洋軟體動物大菱鲆消化腺中的一種蛋白提取物也可從巖藻聚糖中釋放L-巖藻糖,并降低多糖的分子大小[34]。物理法與酶法制備得到的產物在活性方面均優于化學法制備得到的產物,但也有成本高效率低等缺點。

表3 巖藻寡糖的化學制備法

3 瓊膠寡糖(AGOS)

瓊膠是海洋中含量豐富的一類多糖,在制備生物材料等方面應用廣泛。但它由于有類似于褐藻多糖的分子質量大等特點,在生物醫學領域的應用受到很大限制。然而,瓊膠寡糖的分子質量相對較小,有著易降解吸收等優點。瓊膠寡糖的聚合度一般為2～10,制備方法包括化學降解法和酶降解法,降解產物包括瓊寡糖和新瓊寡糖[35]。裂解瓊膠的α-1,3-糖苷鍵,生成以β-D-半乳糖為非還原性末端和以3,6-內醚-α-L-半乳糖為還原性末端的瓊寡糖;裂解瓊膠的β-1,4-糖苷鍵,生成以β-D-半乳糖為還原性末端和以3,6-內醚-α-L-半乳糖為非還原性末端的新瓊寡糖。

表4 瓊膠寡糖的化學制備法

酸降解法應用最為廣泛,普遍采用的是濃度較稀的鹽酸、硫酸、檸檬酸等降解制備瓊膠寡糖。降解時通常采用直接加酸降解、逐級加酸降解、非均相降解等方法。

酶法制備瓊膠寡糖具有反應效率高、產物專一性好、反應條件溫和易控制、無污染等諸多優勢,同時酶法制備得到的產物活性比化學法更高。但是酶制劑分離困難、產量有限、成本高,因而使酶法制備無法大規模應用于生產。

4 卡拉膠寡糖(COS)

卡拉膠主要來源于紅藻的細胞壁,應用較廣泛,但同時有分子質量大、黏度大、空間結構復雜等特點,進而影響其生物活性。根據半乳糖中是否含有內醚以及半乳糖上硫酸基的數量和連接位置不同分為κ-、ι-和λ-型卡拉膠,對應的卡拉膠寡糖也包括κ-、ι-和λ-型卡拉膠寡糖?？ɡz寡糖是卡拉膠降解后的產物,分子質量較小,具有溶解度高、穩定性好等優點,同時安全性較高。

表5所列方法中,甲醇鹽酸法對卡拉膠進行水解,可以降解卡拉膠的半乳糖苷鍵和3,6-脫水半乳糖苷鍵;無機酸可以斷裂卡拉膠分子長鏈中的糖苷鍵,兩種方法均為斷裂單元間糖苷鍵制備卡拉膠寡糖。

表5 卡拉膠寡糖的化學制備法

物理降解法也可以制備卡拉膠寡糖,但反應過程和反應得到的產物較難控制,同時產物結構容易被破壞。酶降解法有反應專一性好、條件溫和、底物專一等優點,但成本高且難以擴大生產規模?？ɡz酶都是內切酶,能夠切割卡拉膠的內部β-1,4-糖苷鍵并產生一系列偶數的寡糖[41]。酶降解法由于可以使多糖按規律降解制備為寡糖,反應溫和,因此酶降解法制備得到的產物活性優于物理降解法和化學降解法。

5 滸苔寡糖(EOS)

滸苔是我國沿海地區常見的一種大型綠藻[42]。近年來,我國黃海海域連年爆發由滸苔構成的綠潮,生物量高達千萬噸[43],對海洋生物生存、海洋運輸構成嚴重影響,因此對滸苔資源進行規?；_發利用具有重要的經濟和社會價值。滸苔多糖主要由鼠李糖、木糖、葡萄糖等單糖組成,富含糖醛酸和硫酸基,主鏈中各單糖間有多種鏈接鍵型[44]。滸苔寡糖是滸苔多糖降解后的產物,相對于滸苔多糖具有更好的溶解性和更顯著的降血脂、抗病毒等功效[45]。

滸苔寡糖的降解制備(表6)中,酸解法是最常用的方法,但在降解過程中易發生硫酸基團脫落的現象。氧化降解法可減少硫酸基團脫落,但產物組成復雜且分離純化困難[48]。酶解法反應條件溫和、專一性強,但反應過程中易形成不飽和鍵,且酶的制備選擇較困難[49]。因此制備時可以將化學法與酶法相結合制備,以達到提質增效的目的。

表6 滸苔寡糖的化學制備法

6 結論與展望

化學法降解制備工藝是目前規模最大的海藻寡糖制備方法,也是當前最成熟的產業化模式。但是幾種海藻寡糖的產業化發展和研究進展不同,褐藻寡糖和紅藻寡糖的研究和制備規模較大,綠藻寡糖的研究較少,但同樣面臨產物活性低和難以實現清潔化生產的問題。酸法或氧化法降解制備寡糖有反應快速、效率高的優點,但同時也有反應過于劇烈、較難控制、寡糖活性較低等缺點。推測將物理法或酶法與化學法相結合是制備工藝發展的趨勢之一,可以此保證產物的聚合度和活性,達到精準化制備的目的,同時減少環境污染問題。當前海藻寡糖的高純產品,如標準品市場的產量低且價格高昂,因此高純度、單一聚合度的寡糖具有廣闊的市場前景。

在應用方面,由于化學法制備得到的寡糖聚合度范圍較大,因此可以將其運用到農肥、飼料和水產餌料等對聚合度要求不高的應用領域,拓展應用范圍,提高應用效率,更好地服務于生態農業和生態養殖業的提質增效。我國化肥使用量巨大,占世界10%的耕地消耗了全球30%的化肥。由于海藻肥中的海藻寡糖等活性成分具有提質增效的效果,可以實現化肥的增效減施,因此海藻肥的應用具有很大的市場前景。根據國家統計局查詢的數據顯示,我國農用化肥施用折純量在近十年呈現出先增長后降低的趨勢,分析原因為2015年農業部制定了《到2020年化肥使用量零增長行動方案》,此方案促進了化肥的減施,取得了明顯成效。但當前化肥施用量仍然巨大,在化肥減施方面還有較大發展空間。在之后的農業生產中,推廣使用海藻肥逐漸替代化肥,將是促進減少化肥用量,同時保證農作物產量的有效途徑。