馬泡瓜中多酚的提取工藝及抗氧化性研究

張麗，郭靖，梁靜靜，劉雨欣

（衡水學院應用化學系，河北 衡水 053000）

馬泡瓜是葫蘆科黃瓜屬的一年生匍匐草本植物，別稱“馬包”，屬于中國的特有植物。馬泡瓜果實內富含維生素E、維生素C、葫蘆素C 等多種營養物質，具有極大的應用價值。研究發現，馬泡瓜籽含有71.4%的多不飽和脂肪酸，含量遠高于菜籽油、大豆油、花生油等日常食用油。馬泡瓜籽油可通過調節腸道菌群來降低血漿膽固醇，研究表明，馬泡瓜籽油具有抗氧化、抗真菌和抗炎活性，具有較大的開發潛力。然而，迄今為止關于馬泡瓜的抗氧化活性的研究很少。因此，本實驗為了實現馬泡瓜的開發與利用，對馬泡瓜中多酚的提取工藝及其抗氧化性能進行研究。

目前，提取植物中多酚的方法日益更新，性能不斷提高，如溶劑提取法、生物酶提取法、超聲波提取法等，對植物多酚的提取率也日益增加。超聲波提取法具有方便、快速、簡單、安全、易于實現工業化等優點。薛治浦等采用超聲波輔助提取技術提取丹參葉總酚酸，通過單因素實驗和Box-Behnken 實驗設計以及響應面分析對提取工藝進行優化，得出較優工藝條件。本實驗使用此方法研究馬泡瓜總酚提取。植物多酚是一類廣泛存在于植物體內的復雜酚類次生代謝物，在自然界儲量非常豐富。植物多酚的結構特點使其具有較強的抗氧化以及清除自由基的能力。多酚類物質是我們需要的天然抗氧化劑，但是人體自身不能合成，因此植物成為人類獲取多酚的重要來源。本實驗利用響應面法優化超聲輔助提取馬泡瓜中的多酚，為馬泡瓜多酚開發提供了一條可行之徑。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

馬泡瓜采摘于河北省衡水市衡水湖附近；沒食子酸、95%乙醇、福林酚原液、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、抗壞血酸、高錳酸鉀，均為分析純。

TD4 臺式低速離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；BL6-180A 超聲波清洗機，上海比朗儀器有限公司；722G 可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；RE-2000A旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗內容

1.2.1 樣品預處理

將馬泡瓜粉末在干燥避光處保存備用。準確稱取1.0 g馬泡瓜粉末置于錐形瓶中，加入10 mL 60%的乙醇溶液作為提取溶劑，設置超聲提取溫度和超聲提取時間分別為55℃和80 min。取少量提取液的上清液置于分光光度計中，760 nm處測其吸光值。

1.2.2 沒食子酸標準曲線的測定

以沒食子酸為標準品。用濃度為95%的乙醇溶液溶解沒食子酸，取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8mL、1.0 mL 溶液分別置于5 支試管中，向每支試管中依次加入5 mL蒸餾水和0.7 mL福林酚原液，混合均勻，靜置反應3 min，再向混合溶液中加入3 mL 7.5%碳酸鈉溶液，最后用蒸餾水定容至10 mL，混合均勻后避光反應50 min。將溶液置于分光光度計中，760 nm 處測其吸光值。為了減小誤差，進行三次平行試驗。

利用Origin 軟件對所測結果進行繪制，結果如圖1所示。方程如式（1）所示：

圖1 沒食子酸標準曲線圖

式中：x—沒食子酸當量濃度，μg/mL；y—吸光值，L/（g·cm）。

1.2.3 馬泡瓜多酚的單因素實驗提取

取馬泡瓜粉末1.000 0 g，液料比（mL/g）為10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，乙醇濃度設為30%、40%、50%、60%、70%，超聲提取，超聲時間為60 min、70min、80 min、90 min、100 min，超聲溫度為35℃、45℃、55℃、65℃、75℃。超聲提取結束后，分別吸取上層清液離心，吸取離心后的上層清液，在5 支試管中分別放置0.1 mL，向每支試管中加入5 mL 蒸餾水，再加0.7 mL福林酚原液，混合均勻后靜置反應3 min，接著把3 mL 7.5%碳酸鈉溶液加入混合溶液中，最后用蒸餾水使之定容至10 mL，混合均勻后避光反應50 min。將溶液置于分光光度計中，760 nm 處測其吸光值。為了減小誤差，進行三次平行試驗，并計算多酚的提取率。探究提取時間對馬泡瓜多酚提取率的影響。

1.2.4 馬泡瓜多酚含量的測定

采用福林酚法進行測定。依據吸光值，計算出馬泡瓜中總酚的提取率。

式中：A—吸光值，L/（g·cm）；V—液體體積，mL；w—固體質量，g。

1.2.5 響應面實驗設計

依據單因素實驗結果，設計響應面實驗，結果見表1。

自變量：提取時間（min）、液料比（mL/g）、乙醇濃度（%）、提取溫度（℃）。

響應值：馬泡瓜總酚的提取率（mg/g）。

1.2.6 馬泡瓜多酚浸膏的制備

在1.2.5 響應面實驗設計最優條件下，超聲并取上清液進行離心，得到馬泡瓜多酚溶液，再次離心，將溶液置于旋轉蒸發器上進行旋蒸操作，從而得到馬泡瓜多酚浸膏。

1.2.7 馬泡瓜多酚的抗氧化性

根據一定比例稀釋馬泡瓜多酚浸膏，測定馬泡瓜多酚溶液對DPPH的清除能力，與VC對DPPH的清除能力進行對比。

將馬泡瓜提取的多酚浸膏溶解，配成不同濃度的馬泡瓜多酚溶液，即濃度為10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、120 μg/mL、150 μg/mL、200μg/mL。

（1）取0.5 mL 馬泡瓜多酚溶液，用稀釋后的DPPH溶液定容至5.0 mL，反應30 min。

（2）取2.0 mL馬泡瓜多酚溶液，加入2.0 mL無水乙醇，反應30 min。

（3）取2.0 mL 蒸餾水，并加入2.0 mL 的DPPH 溶液，反應30 min。

將溶液置于分光光度計中，測量吸光度Ai、Aj、Ao，為保證實驗數據的準確，減小誤差，進行三次平行實驗。

以VC做對照組，將不同濃度的VC溶液代替馬泡瓜多酚溶液，其余操作不變。

根據Ai、Aj、Ao求出多酚溶液對DPPH的清除率：

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果及分析

2.1.1 提取時間對馬泡瓜多酚提取率的影響

由圖2 可知，在一定條件下，馬泡瓜多酚的提取率隨著提取時間的增加，呈現先上升后下降的趨勢。在80 min 時，提取率出現峰值，此時馬泡瓜多酚的提取率最高。當提取時間從60 min 延長到80 min時，馬泡瓜多酚的提取率呈現上升趨勢；提取時間從80 min 延長到100 min 時，提取率則呈現下降趨勢，分析原因可能是提取時間過長，使馬泡瓜多酚發生分解，從而導致提取率降低，不能達到最好的提取效果。

圖2 提取時間與馬泡瓜多酚提取率的關系圖

2.1.2 料液比對馬泡瓜多酚提取率的影響

由圖3 可知，在一定條件下，隨著液料比的增加，馬泡瓜多酚的提取率呈現先上升后緩慢下降的趨勢。當液料比為30∶1（mL/g）時，提取率出現峰值，這時，馬泡瓜多酚的提取率最高。當液料比從10∶1（mL/g）增大到30∶1（mL/g）時，馬泡瓜多酚的提取率呈上升趨勢；液料比從30∶1（mL/g）增大到50∶1（mL/g）時，提取率呈緩慢下降趨勢，分析原因可能由于溶劑增多，使馬泡瓜多酚被稀釋，從而含量降低，提取率也隨之降低。

圖3 液料比與馬泡瓜多酚提取率的關系圖

2.1.3 乙醇濃度對馬泡瓜多酚提取率的影響

由圖4 可知，在一定條件下，可以明顯看到隨著乙醇濃度的增加，馬泡瓜多酚的提取率呈現先上升后急劇下降的趨勢。當乙醇濃度為50%時，提取率出現峰值，此時馬泡瓜多酚的提取率最高。當乙醇濃度從30%提高至50%時，馬泡瓜多酚的提取率呈上升趨勢；乙醇濃度從50%提高至70%時，提取率呈急劇下降趨勢，分析原因由于乙醇濃度的提高破壞了馬泡瓜多酚的結構，從而使馬泡瓜多酚的提取率急劇下降。

圖4 乙醇濃度與馬泡瓜多酚提取率的關系圖

2.1.4 提取溫度對馬泡瓜多酚提取率的影響

由圖5可知，在一定條件下，隨著提取溫度的升高，馬泡瓜多酚提取率呈現先上升后下降的趨勢。當提取溫度從35℃提高到55℃時，馬泡瓜多酚提取率呈上升趨勢，繼續升高提取溫度至75℃時，馬泡瓜多酚的提取率呈下降趨勢?？紤]到溫度過高會破壞多酚結構，導致馬泡瓜多酚變質，因此選用55℃為最佳提取條件。

圖5 提取溫度與馬泡瓜多酚提取率的關系圖

2.1.5 單因素小結

本實驗探究了馬泡瓜多酚的提取條件。實驗表明，當提取時間、液料比、乙醇濃度和提取溫度分別為80min、30∶1（mL/g）、50%、55℃時，馬泡瓜總酚提取率最高。

2.2 響應面優化實驗及統計分析

2.2.1 響應面Box-Behnken優化實驗結果

根據單因素最佳提取條件，采用響應面軟件，設計響應面優化實驗，結果如表2。

表2 響應面Box-Behnken優化實驗結果

將數據擬合，獲得多酚提取率（Y）與提取時間（A）、液料比（B）、乙醇濃度（C）、提取溫度（D）之間關系的二元多項回歸方程：

Y=88.20+1.33B+2.5C+D-1.50AB-2.00AC-2.00AD-2.75BC -1.25BD -1.25CD -24.47A2-23.97B2-25.47C2-25.73D2

由表3可知，F=88.85，說明該模型顯著，只有0.01%的概率使F 值出現這么大。P<0.05 說明該模型項顯著。根據表3可知，C2、A2、B2、C2、D2是重要的模型項，多酚得率極其顯著（p<0.05）。根據表3，馬泡瓜總酚提取受四個因素影響程度：提取時間<提取溫度<液料比<乙醇濃度。

表3 回歸模型各項方差分析

2.2.2 響應面實驗結果分析

由圖6～圖11 可知，通過模型的擬合分析，預測的最佳提取條件：提取時間、液料比、乙醇濃度、提取溫度分別為81 min、31∶1（mL/g）、44%和59℃。進行三次平行實驗，結果如表4 最佳工藝條件及其驗證所示，得到平均提取率為79.042 mg/g，與預測值73.996 mg/g 相當，說明馬泡瓜總酚提取條件可行、合理。

表4 最佳工藝條件及其驗證

圖6 提取時間和液料比對提取率影響關系圖

圖7 提取時間和乙醇濃度對提取率影響關系圖

圖8 提取時間和提取溫度對提取率影響關系圖

圖9 液料比和乙醇濃度對提取率影響關系圖

圖10 液料比和提取溫度對提取率影響關系圖

圖11 乙醇濃度和提取溫度對提取率影響關系圖

2.3 馬泡瓜多酚的抗氧化性研究

由圖12 可知，VC 對DPPH 的清除能力隨溶液濃度的升高而增強，即溶液濃度從10 μg/mL 升高到200 μg/mL 時，清除率從46.59%上升至93.41%，上升了46.82%。馬泡瓜多酚對DPPH 的清除能力隨溶液濃度的升高先增強后減弱，即溶液濃度從10 μg/mL 升高到80 μg/mL 時，清除能力逐漸增強，抗氧化性增強，清除率從4.20%上升至27.87%，上升了23.67%。在80 μg/mL處達到峰值，清除率峰值為27.87%。當溶液濃度從80 μg/mL 升高到200 μg/mL 時，馬泡瓜多酚對DPPH 的清除能力逐漸減弱，抗氧化性逐漸減弱，清除率從27.87%下降至14.53%，降低了13.34%。綜上所述，VC對DPPH 的清除能力較高，而馬泡瓜多酚對DPPH 的清除能力雖然弱于VC，但對其仍具有清除效果。

圖12 總酚、VC對DPPH清除效果的測定

3 結論

本次研究通過單因素實驗，確定提取時間、液料比、乙醇濃度和提取溫度分別為80 min、30∶1（mL/g）、50%和55℃，此時，馬泡瓜總酚提取率最大。

運用響應面模型的預測能力發現，馬泡瓜總酚提取受四個因素影響程度為提取時間<提取溫度<液料比<乙醇濃度，得到最佳提取條件：提取時間、液料比、乙醇濃度和提取溫度分別為81 min、31∶1（mL/g）、44%和59℃，提取率為73.996 mg/g。

本文對比了馬泡瓜多酚及VC 的抗氧化性，結果表明，馬泡瓜多酚具有良好的抗氧化活性，活性隨著濃度的增加先增大后降低；馬泡瓜多酚對于DPPH的清除能力雖然弱于VC，但對其仍具有一定的清除能力。