血清DNMT1和lncRNA MEG3表達水平與帕金森病的關聯性研究

馬 穎, 李琴福, 祁麗霞

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是一種常見的神經系統退行性疾病,患病率逐年升高,已成為神經殘疾的主要原因之一[1]。高齡是患PD最重要的危險因素,且男性患病率高于女性[2-3]。盡管部分PD患者的臨床特征已完全顯現,但其臨床診斷的準確性不高,需進一步探索新的生物標志物。既往研究顯示,DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳學分子機制均不同程度地參與調控PD的發病和發展過程[4]。DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)在維持DNA甲基化中具有重要作用,其表達異?？赡苡绊懟蚪M的穩定性[5]。龜板提取物可通過DNMT1核易位和α-突觸核蛋白(synuclein-alpha,SNCA)甲基化對PD模型多巴胺能神經元發揮保護作用[6]。長鏈非編碼RNA人類母系表達基因3[long non-coding ribonucleic acid(RNA) human maternally expressed gene 3,lncRNA MEG3]在PD患者血漿中表達降低[7]。但目前關于DNMT1、lncRNA MEG3在PD發病中的診斷價值尚不清楚。鑒此,本研究旨在探討PD患者血清DNMT1、lncRNA MEG3表達水平及其臨床意義,現報道如下。

1 對象與方法

1.1研究對象 招募2020年3月至2023年1月青海紅十字醫院神經內科收治的PD患者106例作為PD組,其中男75例,女31例,年齡40.00～82.00(65.71±11.39)歲。另選擇同期本院健康體檢者103名作為對照組,其中男68名,女35名,年齡40～85(65.42±10.16)歲。本研究獲青海紅十字醫院倫理委員會批準(批號:H20191015),研究對象簽署知情同意書。納入標準:(1)患者符合原發性PD診斷標準[8];(2)病歷資料完整;(3)健康體檢者性別、年齡與PD患者相匹配,體格檢查正常,無器質性疾病及認知障礙,無精神疾病或精神疾病史,腦CT檢查無異常。排除標準:(1)合并繼發性PD、其他神經系統退行性疾病、腦血管病、癡呆或腦外傷者;(2)合并免疫系統疾病、感染性疾病、嚴重臟器功能不全或惡性腫瘤者;(3)有藥物濫用史、急慢性毒物接觸史或精神疾病史者;(4)無法配合研究者。

1.2血清DNMT1表達水平測定 采用真空采血管收集研究對象治療前晨起空腹靜脈血3 ml,室溫靜置30 min后以3 000 r/min離心15 min,取上層血清,-80 ℃保存備檢。采用酶聯免疫吸附測定試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測血清DNMT1水平,試劑盒購自上?；钌锟萍加邢薰?。實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3血清lncRNA MEG3表達水平測定 采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測血清lncRNA MEG3水平。采用Trizol法提取總RNA,應用反轉錄試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰?將其反轉錄為cDNA,并以cDNA為模板進行qRT-PCR。反應體系:cDNA(50 ng/μl)4 μl,qPCR SYBR Green Master Mix(上?？道噬锟萍加邢薰?20 μl,上、下游引物(10 μmol/L)各1.6 μl,ddH2O 12.8 μl。lncRNA MEG3上游引物5′-CGGAGAGGCCTATGTTGGT-3′,下游引物5′-GAGACGGTGAGGCTCCTG-3′;GAPDH上游引物5′-CTACGAGCTCAGCTGCAGTAT-3′,下游引物5′-GTAGCGAGTGGCATCTCGG-3′。以GAPDH為內參,通過2-△△CT法計算血清lncRNA MEG3的相對表達量。

1.4臨床資料收集 通過醫院電子病歷系統收集研究對象的臨床資料,包括性別、年齡、受教育年限、體質量指數(body mass index,BMI)、吸煙、飲酒、家族史、高血壓、糖尿病等一般人口學資料。采用美國Beckman公司AU680全自動生化分析儀檢測高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)等實驗室指標。

1.5統一帕金森病評定量表(the Unified Parkinson′s Disease Rating Scale,UPDRS)評分及Hoehn-Yahr(H-Y)分期 (1)收集PD組患者治療前UPDRS Ⅰ評分、UPDRS Ⅱ評分、UPDRS Ⅲ評分[9]。UPDRS Ⅰ評分為精神、行為和情緒評估,包括智力損害、思維障礙、抑郁、動力或始動力。UPDRS Ⅱ評分為日常生活活動評估,包括言語、唾液分泌、吞咽、書寫、切割食物和使用餐具、著裝、個人衛生、翻身和整理床單、跌跤、行走中凍結、行走、震顫、與PD有關的感覺主訴。UPDRS Ⅲ評分為運動檢查評估,包括言語表達、面部表情、靜止性震顫(面部、嘴唇、頜、右上肢、左上肢、右下肢、左下肢)、手部動作性或姿勢性震顫、強直、手指拍打試驗、手運動、輪替運動、腿部靈活性、起立、姿勢、步態、姿勢的穩定性、軀體少動。三種評分均為0～4級,分級越高患者越嚴重。(2)治療前H-Y分期[10]。0期:無癥狀;1期:單側疾病;1.5期:單側和軀干受累;2期:雙側疾病和無平衡障礙;2.5期:輕微雙側疾病和后拉試驗可恢復;3期:輕中度雙側疾病、某種姿勢不穩、獨立生活;4期:嚴重殘疾和仍可獨立站立和行走;5期:無幫助則只能臥床或坐輪椅。

2 結果

2.1兩組臨床資料及血清DNMT1、lncRNA MEG3表達水平比較 PD組病程為(6.69±1.26)年;UPDRS Ⅰ評分(3.62±1.04)分,UPDRS Ⅱ評分(19.78±6.35)分,UPDRS Ⅲ評分(36.03±9.85)分;H-Y分期為0期者16例(15.09%),1～1.5期者32例(30.19%),2～3期者39例(36.79%),4～5期者19例(17.93%)。PD組血清DNMT1水平高于對照組,TC、TG、LDL-C及lncRNA MEG3水平低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。兩組性別、年齡、BMI、吸煙、飲酒、家族史、高血壓、糖尿病、HDL-C水平、受教育年限比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組臨床資料及血清DNMT1、lncRNA MEG3表達水平比較

2.2PD患者血清DNMT1、lncRNA MEG3水平與臨床指標的相關性分析結果 Pearson相關性分析結果顯示,PD患者血清DNMT1水平與TC、TG、LDL-C水平呈負相關(P<0.05),與UPDRS Ⅰ評分、UPDRS Ⅱ評分、UPDRS Ⅲ評分、H-Y分期呈正相關(P<0.05)。lncRNA MEG3水平與TC、TG、LDL-C水平呈正相關(P<0.05),與UPDRS Ⅰ評分、UPDRS Ⅱ評分、UPDRS Ⅲ評分、H-Y分期呈負相關(P<0.05)。見表2。

表2 PD患者血清DNMT1、lncRNA MEG3水平與臨床指標的相關性分析結果

2.3PD發生的多因素logistic回歸分析結果 以發生PD情況為因變量(發生=1;未發生=0),將表1中有統計學意義的指標作為自變量進行多因素logistic回歸分析,結果顯示,較高的血清DNMT1水平是促進PD發生的獨立危險因素(P<0.05),較高的lncRNA MEG3水平是抑制PD發生的獨立保護因素(P<0.05)。見表3。

表3 PD發生的多因素logistic回歸分析結果

2.4血清DNMT1、lncRNA MEG3水平對PD的診斷價值 ROC曲線分析結果顯示,血清DNMT1、lncRNA MEG3水平具有診斷PD的應用價值(P<0.05),且兩指標聯合可進一步提高診斷效能[AUC(95%CI)=0.906(0.865～0.947)],靈敏度和特異度分別為80.21%、89.34%。見圖1,表4。

圖1 血清DNMT1、lncRNA MEG3水平診斷PD的ROC曲線圖

表4 血清DNMT1、lncRNA MEG3水平診斷PD的ROC曲線分析結果

3 討論

3.1PD的病理特征包括路易體和路易神經炎形式的神經內含物,黑質和其他腦區細胞丟失[11]。盡管PD的發病機制和流行病學研究已取得一定進展,但對其病因仍不十分明確,且尚未發現有效的治愈或預防方法[12-13]。由于PD的臨床特征與其他神經退行性疾病有重疊,因此PD診斷仍是目前臨床面臨的一個挑戰[14]。

3.2既往研究顯示,環境因素可能通過誘導表觀遺傳修飾(如DNA甲基化)導致神經退行性變,且此過程是由DNMT1等酶進行調控的[15]。Saxena等[16]研究結果發現,神經元中過表達DNMT1可造成精神分裂癥相關基因失調。Zhang等[17]研究表明,在PD模型細胞和小鼠中DNMT1蛋白表達水平顯著降低。而本研究結果中PD患者血清DNMT1表達上調,與Zhang等[17]的研究結果相反。分析認為在炎癥等病理狀態可能導致細胞破裂增加,DNMT1可能經細胞釋放進入血液,使得血清DNMT1的檢測濃度升高,值得擴大樣本量對此進一步驗證。lncRNA廣泛參與代謝和免疫等關鍵生理過程,并與腫瘤、心血管疾病、腎病和神經系統疾病的發生、發展密切相關[18]。Zhao等[19]研究發現lncRNA MEG3在神經元細胞死亡,以及缺氧、缺血條件下血管生成等方面發揮關鍵作用。

3.3有研究顯示,DNMT1可以通過招募甲基轉移酶來促進lncRNA MEG3啟動子甲基化以抑制lncRNA MEG3表達[20]。推測DNMT1、lncRNA MEG3可能共同參與PD患者神經細胞凋亡。Huang等[21]研究結果發現,lncRNA MEG3在PD患者中表達降低,lncRNA MEG3可通過調節人神經母細胞瘤細胞中富含亮氨酸重復激酶2的表達來調控細胞生存能力和凋亡?；诩韧芯糠治稣J為,病理因素造成患者體內血清DNMT1表達異常升高,促進DNA甲基化的作用增加,進而通過招募甲基轉移酶促進lncRNA MEG3啟動子甲基化,抑制血清lncRNA MEG3表達。另外,DNMT1、lncRNA MEG3可能共同影響PD患者神經炎癥。Meng等[22]研究表明,lncRNA MEG3可通過靶向相關信號通路調節小膠質細胞炎癥。推測DNMT1可能通過調控lncRNA MEG3表達,調節小膠質細胞炎癥,通過影響神經炎癥參與PD患者腦損傷。本研究多因素logistic回歸分析及ROC曲線分析結果提示,DNMT1、lncRNA MEG3可能參與PD發病,且兩指標聯合檢測有助于臨床早期確診PD。

3.4本研究結果顯示PD患者TC、TG、LDL-C水平較健康人群低,這與張展輿等[23]研究結果相似,且各指標水平與血清DNMT1水平呈負相關,與lncRNA MEG3水平呈正相關。分析PD患者血脂水平降低的可能原因為:(1)PD患者往往伴隨著交感神經活動降低,皮質醇和兒茶酚胺產生量減少,最終造成血脂水平降低。(2)在PD發展初期可能已伴隨血脂水平降低,脂質水平降低可進一步降低輔酶Q的水平,而輔酶Q主要功能為神經保護和降低氧化應激,進而延遲或減少多巴胺的進一步消耗[24]。既往研究表明,DNA甲基化是環境因素(如飲食)和復雜疾病(如酒精性脂肪肝)之間的表觀遺傳學聯系,其在肝臟脂質代謝調控中發揮重要作用,進而導致脂肪肝變性的發展[25]。Zou等[26]研究結果表明,lncRNA MEG3相關信號通路可通過控制參與脂質代謝和炎癥的基因的表達,參與體內脂質積聚和炎癥發應。因此推測DNMT1、lncRNA MEG3也可能通過調控體內血脂代謝的方式參與PD的疾病進展,其具體作用機制仍有待進一步研究。

綜上所述,PD患者血清DNMT1呈高表達,lncRNA MEG3呈低表達,二者聯合檢測有助于臨床診斷PD。但本文未進一步探討PD不同亞型中血清DNMT1、lncRNA MEG3的表達水平差異,有待后續進一步擴大樣本量加以研究,為PD患者的個體化治療方法研發提供參考。