紫檀芪通過調控氧化應激和NLRP3炎癥小體抑制肝癌增殖遷移

劉晨, 曾烏查, 黃赟

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的肝惡性腫瘤類型,約占肝惡性腫瘤總病例數的90%[1-2]。HCC的病因主要有病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝和酒精相關性肝病等[2]。近年來,盡管在治療性手術(手術切除和肝移植)、放療、全身化療、靶向治療和免疫治療等方面取得了進展,但HCC患者的預后較其他癌癥仍然較差[2]。因此,尋找新的、有效的干預策略,探索更多有效的輔助治療方案,對提高HCC患者長期生存率具有重要的臨床意義和社會價值。

近年來,從中草藥中尋找高效、低毒的輔助抗癌藥物成為腫瘤治療研究的新熱點。紫檀芪(pterostilbene,PTE,3,5-二甲氧基-4′-羥基苯乙烯)是一種酚類化合物,提取自紫檀、藍莓和花櫚木等天然作物中,具有多種藥理作用,包括抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗纖維化和抗衰老等[3-4]。PTE能夠激活多種信號通路從而抑制腫瘤的發生、發展,其廣泛的抗癌活性、逆轉化療藥物的耐藥性以及增加放療敏感性等作用已在乳腺癌、宮頸癌和結腸癌等腫瘤中得到驗證[5]。已有研究[6-9]報道,PTE在肝臟中的保護作用可能與其抗氧化應激、抗炎等作用密切相關。本研究旨在探索PTE在HCC增殖和遷移過程中的作用機制,并探討PTE對氧化應激和 NLRP3 炎癥小體的影響,以期為PTE進一步應用于HCC的臨床治療提供新的思路和依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和細胞系 PTE(純度>97 %,上海Aladdin公司);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT]試劑盒、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、VAS2870、N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)、過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(美國Sigma-Aldrich公司);白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-18 ELISA試劑盒(美國Life Technologies公司);核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain, leucine-rich repeat and pyrin domain-containing3,NLRP3)、凋亡相關的斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteine-requiring aspartate protease 1,Caspase-1)、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(recombinant nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)、IL-1β抗體、周期蛋白-D1(Cyclin D1,CCND1)抗體、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)抗體(美國Cell Signaling Technology公司);抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(美國Proteintech公司);磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、改良Eagle培養基(dulbecco’s modified eagle medium, DMEM)(美國Gibico公司);草酸銨結晶紫染色液(北京 Solarbio 公司);Transwell細胞培養小室(美國康寧公司);永生化人肝細胞LO2、HCC Hep3B、HepG2、Bel-7404 (上海中喬新舟生物技術有限公司);HCC Bel-7402 (上海聯邁生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞在37 ℃、體積分數為0.05的CO2培養箱中培養。當細胞融合達70% 密度時更換為無血清培養基,再給予藥物處理。

1.2.2 平板克隆形成實驗 細胞以200 個/孔的密度種植于6孔培養板上。培養14 d后用PBS洗滌,再用2.0% 結晶紫染色。使用顯微鏡對細胞克隆團進行計數,并確保每個細胞團含50個以上細胞。

1.2.3 細胞存活率及增殖能力檢測 采用MTT細胞增殖實驗檢測細胞的存活率和增殖情況。細胞以1 500個/孔(用于測定增殖活力)或5 000個/孔(用于測定存活率)的密度種植在96孔板中,培養1～2 d。PTE預處理后每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)。孵育4 h后去除培養基,每孔加入150 μL DMSO。在490 nm波長下測量光密度(optical density, OD)值。

1.2.4 細胞劃痕實驗 細胞用PTE預處理后接種于6 孔板中。當細胞生長密度為80%時,用移液器吸頭尖端劃痕,PBS(pH值=7.4)小心洗去殘留的細胞碎片,再加入含2% FBS的DMEM繼續培養。同一位置在0、24、48 h 時間點進行拍照以觀察細胞遷移情況。

1.2.5 細胞遷移實驗 采用Transwell實驗評估細胞遷移能力。將細胞(密度為1×105個/孔)用不含FBS的DMEM培養基培養于Transwell裝置的上室中,下室用500 μL含10% FBS的DMEM填充,37 ℃下孵育18 h。孵育期結束后,將底膜完整剪切并用2.0% 結晶紫染色。顯微鏡下隨機選擇5個不同視野拍照并統計。

1.2.6 EdU細胞增殖實驗 使用Apolo488體外成像試劑盒進行EdU細胞增殖檢測。用10 μmol/L的EdU試劑孵育Bel-7404和Hep3B細胞2 h,用4%多聚甲醛室溫固定30 min,再用 0.3% Triton X-100透化并配合EdU試劑染色。細胞核用5 μg/mL 的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色10 min。在熒光顯微鏡下,計數5個隨機視野中EdU陽性細胞的數量并進行統計分析。

1.2.7 免疫熒光染色 將Hep3B細胞以1×105個/孔密度接種在24孔板內的玻璃蓋玻片上。過夜培養后,用PBS洗滌細胞3次,并在室溫下以4%多聚甲醛固定20 min。洗滌3次后,加入0.1% Triton X-100 室溫下靜置15 min。洗滌3次后,再加入5% BSA 37 ℃ 孵育30 min。加一抗在4 ℃下孵育16 h。復溫洗滌3 次后,再加入二抗37 ℃ 孵育 1 h。最后使用DAPI染細胞核,封片。采用Olympus FV10i-W共焦顯微鏡觀察并拍攝圖片。

1.2.8 Western-blot實驗 4 ℃條件下提取細胞蛋白,加入蛋白裂解液30 min后超聲碎裂細胞,離心(12 000×g,4 ℃,15 min)后轉移上清,測蛋白濃度。加入1/4體積的loading buffer,沸水浴10 min后自然冷卻。配置10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離蛋白,濕轉法轉膜,5% BSA中室溫下封閉1 h,后用相應一抗4 ℃孵育過夜(GAPDH稀釋比例為1∶2 000,NOX4、NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β稀釋比例均為1∶1 000),洗滌后用相應二抗(稀釋比例為1∶10 000)室溫下孵育1 h。最后用電化學發光法進行顯影,以GAPDH 作為對照內參進行半定量分析。

1.2.9 qRT-PCR實驗 加入1 mL TRIzol裂解細胞,提取總RNA。采用TakaRa Prime script RT reagent kit 進行cDNA逆轉錄操作。采用TAKARA試劑盒及實時熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR分析。使用2-△△Ct計算目的基因的相對表達量。引物序列如下：

NOX4：

正向TCCATTGAAAGCACTGTGTCG

反向CACATGCACGCCTGAGAAAA

GAPDH：

正向CTGCACCACCAACTGCTTAG

反向GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT

1.2.10 H2O2檢測 收集貼壁細胞并裂解,離心收集上清液。向避光的96孔板每個孔中加入待測樣品或標準品50 μL,再加入H2O2檢測試劑100 μL,室溫條件下孵育30 min;孵育完成后用酶標儀在560 nm波長條件下測定。根據標準曲線計算出相應樣品內H2O2的濃度。

1.2.11 細胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測 消化貼壁細胞,800 r/min離心3 min,用PBS洗滌 2 次后重懸,將細胞密度調整為5×104mL-1。把細胞懸液依次加入96孔板內,每孔 100 μL,孵育過夜。裝載探針,使用無血清的DMEM培養基按1∶1 000的比例稀釋2′,7′-二氫二氯熒光素二乙酸酯(2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA),直至終濃度為10 μmol/L。洗滌樣品2遍后,向每孔樣品中加入稀釋后的DCFH-DA工作液200 μL,37 ℃條件下孵育30 min。孵育完成再洗滌 3 次后行熒光檢測,采用酶標儀檢測熒光值,在480 nm的激發波長和525 nm 的發射波長下定量DCFH-DA熒光。

1.2.12 ELISA法檢測IL-1β使用IL-1βELISA檢測試劑盒進行檢測。裂解細胞后,離心收集上清液。在反應板中每孔各加入標準品或待測樣品100 μL,充分混勻后于37 ℃放置120 min。用洗滌液充分洗滌4～6 次后,再往每孔中加入一抗工作液100 μL充分混勻,37 ℃靜置60 min。每次洗板后,按先后順序分別往每孔加酶標抗體工作液100 μL(37 ℃,30 min)、酶標抗體工作液100 μL(37 ℃,30 min)和底物工作液100 μL(37 ℃暗處反應15 min)。最后每孔加入100 μL終止液混勻,立即用酶標儀在450 nm處測OD值。繪制標準曲線,計算相應樣品內IL-1β的實際濃度。

1.2.13 ELISA法檢測IL-18 使用IL-18 ELISA檢測試劑盒進行檢測。裂解細胞后,離心收集上清液。在酶標板中每孔各加入標準品或待測樣品100 μL,37 ℃孵育90 min。棄去液體甩干后,每孔加入抗體工作液100 μL,37 ℃孵育60 min。洗板后,每孔再加入酶結合物工作液100 μL,37 ℃ 孵育30 min。再次洗板后,每孔加入底物溶液90 μL,37 ℃避光孵育15 min。最后每孔加入 50 μL 終止液混勻,立即用酶標儀在450 nm處測OD值。繪制標準曲線,計算相應樣品內IL-18的實際濃度。

2 結 果

2.1 PTE對肝細胞和HCC生存能力的影響 采用MTT實驗測定PTE對正常人肝細胞系LO2和4種人HCC細胞系(Hep3B、HepG2、Bel-7402和Bel-7404)生存能力的影響。將細胞置于不同濃度的PTE或不同刺激時間下進行培養,可見PTE抑制Hep3B、HepG2、Bel-7402和Bel-7404細胞的生存能力,且有濃度依賴性。其中,50%有效抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)分別為(53.16±3.49)、(60.30±2.19)、(61.85±4.15)、(51.61±2.80) μmol/L。然而,在相同濃度或者相同刺激時間的PTE作用下,永生化人肝細胞LO2的存活率所受影響較小,IC50為(92.65±8.15) μmol/L。選取濃度為60 μmol/L的PTE進行進一步實驗,發現該濃度的PTE刺激可以有效抑制HCC細胞的生存能力,并呈明顯的時間依賴性。96 h 培養時間內,PTE對正常人肝細胞系LO2僅顯示出輕微的抑制作用(LO2組與 Hep3B、HepG2、Bel-7402和Bel-7404 組比較,差別有統計學意義,t值分別為3.43、2.85、3.01和3.45,P<0.01)。上述結果表明,在體外實驗中PTE能夠降低HCC細胞的生存能力(圖1A)。

PTE：紫檀芪;CCND1：周期蛋白-D1;MTT：3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽;DAPI：4′,6-二脒基-2-苯基吲哚;EdU：5-乙炔基-2′-脫氧尿苷。A：細胞存活率;B：MTT實驗;C：平板克隆實驗;D：EdU實驗;E：Western-blot實驗(PTE組：60 μmol/L濃度的PTE刺激48 h)。與0 μmol/L組或control組比較,△：P<0.05;與50 μmol/L組比較,#：P<0.05。

2.2 PTE對HCC增殖能力的影響 MTT實驗結果顯示,隨著PTE刺激濃度增加,Hep3B和Bel-7404 細胞增殖曲線逐漸趨于平緩(Hep3B細胞組間比較,F=9.02,P<0.01;Bel-740細胞組間比較,F=10.09,P<0.01),說明PTE可降低Hep3B和Bel-7404細胞的增殖速度且具有濃度依賴性(圖1B)。平板克隆形成實驗結果顯示,隨著PTE刺激濃度的增加,細胞集落形成數量呈明顯下降(Bel-7404細胞3組間比較,F=9.02,P<0.01;Hep3B細胞3組間比較,F=10.09,P<0.01,圖1C)。EdU細胞增殖實驗結果提示,PTE刺激后Hep3B和Bel-7404細胞增殖能力減弱,表現為S期細胞核紅色染色(陽性細胞數)比例減少,與0 μmol/L組比較,差別有統計學意義(Bel-7404細胞3組間比較,F=62.56,P<0.01;Hep3B細胞3組間比較,F=30.66,P<0.01,圖1D)。Western-blot實驗結果提示,PTE(60 μmol/L)刺激后Bel-7404和Hep3B細胞中CCND1蛋白水平下調(Bel-7404：t=5.09,P<0.01;Hep3B：t=9.21,P<0.01,圖1E)。以上體外實驗結果表明,PTE降低了HCC細胞的增殖能力。

2.3 PTE對HCC體外遷移能力的影響 采用不同濃度的PTE(50和60 μmol/L)刺激Bel-7404和Hep3B細胞48 h。細胞劃痕實驗結果表明,與0 h組比較,48 h后PTE組的細胞遷移能力降低,并顯示出濃度依賴性。不同濃度PTE作用48 h后,與0 μmol/L組比較,Hep3B細胞殘余劃痕面積的差別均有統計學意義(P<0.01);Bel-7404細胞殘余劃痕面積亦存在差別(P<0.01,圖2A)。Transwell實驗結果證實,Bel-7404和Hep3B細胞的遷移數目也被PTE抑制,并顯示出濃度依賴性(Bel-7404細胞組間比較,F=52.34,P<0.01;Hep3B細胞組間比較,F=39.28,P<0.01,圖2B)。Western-blot 實驗結果提示,PTE(60 μmol/L)刺激后Hep3B和Bel-7404細胞中的E-cadherin蛋白水平上調及N-cadherin 蛋白水平下調(圖2C)。以上體外實驗結果表明,PTE可以抑制HCC細胞的遷移能力。

PTE：紫檀芪;E-cadherin：E-鈣黏蛋白;N-cadherin：N-鈣黏蛋白;GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶。A：細胞劃痕實驗;B：Transwell 實驗;C：Western-blot實驗(PTE組：60 μmol/L濃度的PTE刺激48 h)。與0 μmol/L組或control組比較,△：P<0.05;與50 μmol/L組比較,#：P<0.05。

2.4 PTE對Hep3B細胞氧化應激的影響 PTE能下調Hep3B細胞中H2O2的水平,具有明顯的劑量依賴性(F=105.02,P<0.01,圖3A)。PTE亦能下調Hep3B細胞中ROS的水平,該效應同樣具有劑量依賴性(F=247.92,P<0.01,圖3B)。以上結果證實,PTE可以抑制Hep3B細胞中的氧化應激水平。

PTE：紫檀芪;H2O2：過氧化氫;NAC：N-乙酰半胱氨酸;NOX4：尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4;GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶;DCFH-DA：2′,7′-二氫二氯熒光素二乙酸酯。A和C：過氧化氫濃度測定;B、D和G：ROS活性檢測;E：Western-blot實驗;F：qRT-PCR實驗測定NOX4的 mRNA表達水平。與0 μmol/L組或control組比較,△：P<0.05;與50 μmol/L組比較,#：P<0.05;與H2O2組比較,▲：P<0.05;與PTE組比較,◆：P<0.05;與VAS2870組比較,★：P<0.05。

給予經典的ROS誘導劑H2O2(100 mmol/L)刺激2 h后,Hep3B細胞中的H2O2水平明顯升高,但這一變化可被PTE(60 μmol/L)所抑制(圖3C);其中,PTE組、H2O2組分別與control組比較,差別有統計學意義(PTE組vscontrol組,t=15.04,P<0.01;H2O2組vscontrol組,t=7.89,P<0.01),PTE+H2O2組與PTE組比較,差別有統計學意義(t=6.24,P<0.01)。PTE(60 μmol/L)與過氧化物抑制劑NAC的聯合應用對ROS的抑制作用產生疊加效應(PTE組vscontrol組,t=11.97,P<0.01;NAC組vs control組,t=21.21,P<0.01;PTE+NAC組vsPTE組,t=6.49,P<0.01)(圖3D)。

2.5 PTE對Hep3B細胞NOX4表達的影響 PTE刺激48 h后,Hep3B中細胞NOX4蛋白表達水平明顯下調,并呈現出劑量依賴性(F=323.40,P<0.01,圖3E)。同樣予PTE處理后,Hep3B中細胞NOX4 mRNA表達水平明顯下調,并呈現劑量依賴性(F=271.10,P<0.01,圖3F)。上述實驗結果表明,PTE對ROS的抑制作用可能與其調控NOX4相關。PTE和VAS2870的聯合應用對ROS的抑制作用產生疊加效應(圖3G)。以上結果表明,PTE對Hep3B細胞增殖和遷移能力的抑制,可能是通過下調細胞內NOX4來源的ROS水平實現。

2.6 PTE對Hep3B細胞NLRP3炎癥小體活化的影響 PTE刺激48 h后,Hep3B細胞中NLRP3、ASC、Caspase-1(p10)和IL-1β的蛋白表達水平呈現出劑量依賴性下調(圖4A)。免疫熒光染色結果顯示,與control組比較,LPS組中NLRP3、ASC、Caspase-1(p10)和IL-1β表達明顯增多;而予PTE(60 μmol/L)處理后,LPS+PTE組中NLRP3、ASC、Caspase-1(p10)和IL-1β蛋白表達水平較LPS組下降。以上結果表明,LPS誘導的NLRP3炎癥小體復合物的組裝被PTE所抑制(圖4B)。

PTE：紫檀芪;H2O2：過氧化氫;LPS：脂多糖;NAC：N-乙酰半胱氨酸;IL-1β：白細胞介素1β;IL-18：白細胞介素18;NLRP3：核苷酸結合寡聚化結域樣受體蛋白3;ASC：凋亡相關的斑點樣蛋白;Caspase-1：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1;Merge：融合;DAPI：4′,6-二脒基-2-苯基吲哚;GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶。A和C：Western-blot實驗測定NLRP3、ASC、Caspase-1(p10)和IL-1β的蛋白表達水平;B：NLRP3 炎癥小體組裝圖(細胞免疫熒光染色);D：IL-1β濃度測定;E：IL-18濃度測定。與0 μmol/L組或control組比較,△：P<0.05;與50 μmol/L 組比較,#：P<0.05;與LPS組比較,▲：P<0.05;與H2O2組比較,◆：P<0.05。

使用經典的炎癥誘導因子LPS或ROS誘導劑H2O2刺激Hep3B細胞后,明顯上調NLRP3、ASC、Caspase-1(p10)和IL-1β的蛋白表達水平,但PTE干預后下調NLRP3、ASC、Caspase-1(p10)和IL-1β的表達水平(圖4C)。檢測Hep3B細胞中IL-1β和IL-18的水平：LPS或H2O2刺激Hep3B細胞后,明顯上調Hep3B細胞中IL-1β和IL-18水平,但PTE干預后下調了IL-1β和IL-18水平(圖4D、E)。上述結果證實,PTE可以抑制Hep3B細胞中NLRP3炎癥小體的活化,并下調下游IL-1β和IL-18的表達水平。

2.7 PTE通過調控氧化應激和NLRP3炎癥小體抑制HCC的增殖和遷移 MTT實驗結果提示,LPS或H2O2刺激后可明顯增強Hep3B細胞的增殖能力(control組vsLPS組,t=3.73,P=0.015;control 組vsH2O2組,t=2.69,P=0.035),而PTE干預后(60 μmol/L)可抵消上述刺激的變化(圖5A)。Transwell 實驗證實,LPS或H2O2刺激可明顯增強Hep3B細胞的遷移能力(control組vsLPS組,t=5.41,P<0.01;control組vsH2O2組,t=3.44,P=0.026),加入PTE干預后上述趨勢發生逆轉(圖5B)。上述結果再次驗證,PTE可通過抑制氧化應激和NLRP3炎癥小體,從而抑制HCC的增殖與遷移能力(圖5C)。

PTE：紫檀芪;H2O2：過氧化氫;LPS：脂多糖;IL-1β：白細胞介素1β;IL-18：白細胞介素18;NLRP3：核苷酸結合寡聚化結域樣受體蛋白3;ASC：凋亡相關的斑點樣蛋白;Caspase-1：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1;NOX4：尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4;ROS：細胞活性氧;MTT：3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽;HCC：肝細胞癌。A：MTT實驗;B：Transwell實驗;C：研究機制示意圖。與0 μmol/L組或control組比較,△：P<0.05;與LPS組比較,▲：P<0.05;與H2O2組比較,◆：P<0.05。

3 討 論

我國是肝癌高發地區,每年全球約50%的新發肝癌病例發生在中國。此外,我國每年肝癌死亡病例數占全球的50%,且大多數HCC的患者被確診時通常已處于晚期[10]。中國HCC患者的 5 a 總生存率為12%,中位死亡時間為23個月[10]。目前臨床上對晚期HCC的治療手段有限且效果欠佳。既往文獻[3]也證實,PTE在人體內毒性小,可以被迅速吸收且廣泛分布,具有較好的代謝穩定性和生物利用度。本研究比較了4種HCC與正常肝細胞LO2在PTE刺激下存活率的差別,結果提示,在相同濃度和刺激時間下,PTE對于正常肝細胞僅有輕微毒性,從而間接證明了PTE治療的安全性,與既往的研究[3]結果一致。因此,PTE可以作為一種天然、安全和有效的肝癌治療輔助藥物。

本研究結果發現,PTE可以有效抑制HCC細胞的增殖能力和集落形成能力。在多種腫瘤中,細胞周期蛋白CCND1的過度表達并伴隨細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases,CDK)活性的失調,引發腫瘤細胞異常增殖[11-12]。本研究發現,PTE刺激后Hep3B和Bel-7404細胞中CCND1蛋白的表達明顯減少。此外,細胞劃痕實驗和Transwell 實驗結果均證實,PTE具有抑制HCC細胞遷移的作用。上皮-間充質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)信號在腫瘤細胞遷移表型中起重要調控作用[13-14]。本研究證明,PTE刺激后HCC中EMT信號受到抑制,具體表現為E-cadherin的表達增加和N-cadherin的表達降低。綜上,PTE在體外能夠有效抑制HCC細胞的增殖和遷移。

氧化應激系指體內氧化和抗氧化這2個拮抗體系的失衡所引起的機體生化、生理過程異常。其中,ROS是最重要的氧化劑;在氧化應激條件下,過量的ROS會激活各種轉錄因子,導致炎癥、腫瘤細胞增殖、遷移和血管生成等[15]。研究[15]表明,ROS在肝癌的發生、發展機制中發揮著雙重作用：一方面ROS可促進DNA損傷,導致潛在致癌突變的發生;ROS還可以作為信號分子來驅動腫瘤細胞增殖、遷移,包括增強EMT、癌細胞的遷移和侵襲以及與內皮細胞的黏附作用;ROS能通過改變表觀遺傳調控促進肝癌發生、發展;ROS還被證明在HCC細胞中激活TGF-β1/Smad3/Xct通路,增強肝癌的脂質過氧化作用[16]。另一方面,過量的ROS增加氧化損傷、細胞衰老,增強ROS依賴性的死亡方式比如凋亡、焦亡和鐵死亡等,從而限制腫瘤的進展[15]。本研究發現,PTE抑制了Hep3B細胞中ROS和 H2O2水平;而用經典的ROS誘導劑H2O2刺激Hep3B細胞后,細胞中的ROS水平升高,但這一變化可被PTE所抑制。PTE聯合過氧化物抑制劑NAC能夠進一步下調細胞內ROS和H2O2水平。

NOX是一類以生成活性氧類物質為主要功能的蛋白復合體,NOX的多種蛋白亞基如NOX1、NOX2及NOX4等均參與HCC的發生、發展過程[17-19];其中,既往文獻[18-21]已證實NOX4的高表達與HCC的預后密切相關,它能通過調控EMT、癌細胞死亡方式以及巨噬細胞分化等過程,參與HCC的發生、發展。因此,NOX4已經成為抗腫瘤治療的一個重要靶點。生理狀態下,NOX4能持續產生低水平H2O2,且NOX4主要通過自身mRNA水平調節ROS生成;NOX4作為ROS的主要來源之一,病理狀態下NOX4過表達會引起ROS生成明顯增多,體內氧化應激平衡被打破[22]。在腫瘤微環境中,NOX4是能量代謝的感受器,當線粒體ATP下降時,NOX4活性增強,ROS產生增多,從而導致腫瘤細胞凋亡被抑制[23]。本研究結果證實,PTE在體外實驗中顯著降低Hep3B細胞中NOX4轉錄和翻譯的表達水平;PTE與NOX4特異性阻斷劑VAS2870的聯合應用對HCC中ROS和H2O2的抑制作用產生了疊加效應。以上結果說明,PTE通過調控NOX4這個關鍵分子,影響Hep3B細胞的氧化應激水平,進而抑制細胞的增殖和遷移能力。因此,可以推斷PTE對ROS的抑制作用與其下調NOX4的表達相關,通過阻斷細胞內NOX4來源的ROS生成是PTE抑制Hep3B細胞增殖、遷移作用的可能機制之一。

NLRP3炎癥小體復合物是目前結構和功能最明確的一種炎癥小體,主要由模式識別受體NLRP3,銜接分子ASC和效應分子前體Caspase-1組成[24]。炎癥小體能夠識別病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)或者內源性損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs),募集和激活促炎癥蛋白酶Caspase-1;活化的Caspase-1切割IL-1β和IL-18 的前體,產生成熟的IL-1β和IL-18,發揮促炎作用[24]。既往研究[25-27]已證實,NLRP3炎癥小體能介導各種促炎細胞因子分泌,與HCC的增殖、侵襲、血管生產和遷移等各個階段的進展均有密切相關。ROS被認為是驅動NLRP3炎癥小體活化的主要因素之一[24];ROS可以觸發NLRP3炎癥小體激活,進而抑制癌細胞的增殖和遷移[6,25,28-29]。本研究發現,PTE明顯下調了Hep3B細胞中NLRP3炎癥小體組分NLRP3、ASC和Caspase-1(p10)的表達水平,進而抑制了炎癥小體的活化組裝。此外,使用經典的炎癥誘導因子LPS或者ROS誘導劑H2O2刺激Hep3B細胞可以上調NLRP3炎癥小體組分的表達,但這一效應亦能被PTE所抑制。PTE對NLRP3炎癥小體的抑制作用也進一步下調了其下游的IL-1β和IL-18分泌水平,從而抑制炎癥反應。以上結果表明,PTE抑制ROS誘導的NLRP3炎癥小體激活,可能是PTE抑制Hep3B細胞增殖和遷移產生的分子機制之一。此外,核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB) 信號通路的激活被認為是NLRP3炎癥小體活化啟動階段的重要標志[24]。已有研究[30-31]報道,柴胡皂苷D及延齡草提取物可以通過ROS/NF-κB/NLRP3/GSDMD信號軸調控肺癌的增殖和遷移。同時,既往多數文獻[32-33]證實,PTE對NF-κB信號通路活化起到抑制作用,可以抑制腫瘤細胞的增殖和遷移;在肝癌中PTE對NF-κB 信號通路的作用值得進一步深入探討。

本研究存在以下不足之處：PTE對NLRP3炎癥小體活化的具體機制缺乏進一步探討,后續的研究將結合NF-κB信號通路進行更深入的探討。同時,本研究缺乏PTE在體內實驗方面抑制HCC增殖、遷移的相關數據,在后續研究中可以采用原位種植方法在裸鼠肝包膜下接種熒光標記的HCC,采用體外動態顯影方式追蹤細胞遷移情況。