甲狀腺乳頭狀癌組織miR-221-3p表達與淋巴結轉移危險因素分析*

梁 陽，鄧一林，吳佩玲，毛 俐△，汪廣杰

1.中國人民解放軍西部戰區總醫院 病理科（成都 610083）；2.成都醫學院 公共衛生學院（成都 610500）；3.中國人民解放軍西部戰區總醫院 腫瘤科（成都 610083）

近年來，甲狀腺癌已經成為我國常見的惡性內分泌腫瘤，約70%～80%甲狀腺癌屬于甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）[1]。PTC易局部浸潤和遠處轉移，因此尋找新的預后診斷標志物，對PTC患者臨床預后有重要意義。miRNA是一類非編碼短鏈RNA的總稱，多數情況下通過結合靶基因mRNA 3'-非翻譯區，導致mRNA降解或翻譯沉默[2-3]。文獻研究[4-5]發現，miR-221-3p在多種腫瘤中異常表達，并影響腫瘤患者臨床預后。目前研究[6]僅發現BRAF V600E基因在PTC中異常表達，且對PTC預后研究甚少。本研究旨在探討miR-221-3p在PTC組織中的表達水平及其與患者臨床病理特征和預后之間的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2020 年10 月至2021 年7 月西部戰區總醫院收治的PTC患者26 例。納入標準：1）首次診治，術前未接受任何治療；2）均經甲狀腺全切或次全切手術后病理學確診為PTC；3）臨床病例資料完整，年齡≥18 歲；4）簽訂知情同意書。排除標準：1）合并甲狀腺其他疾病或其他部位惡性腫瘤者；2）有精神疾病者。PTC患者中，男7 例，女19 例；年齡26～84（46.23±12.67）歲；腫瘤最大直徑（1.55±1.34）cm；淋巴結轉移9 例。另選取經超聲穿刺病理活檢明確為健康者23 例作為對照組，其中，男6 例，女17 例；年齡26～60（41.89±10.31）歲。組間性別、年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本試驗研究經成都醫學院倫理委員會批準（倫理審批號：CMCEC-2022 No.18），所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 冰凍免疫組織化學染色 對臨床切除的甲狀腺組織行局部解剖術，區分正常甲狀腺組織及PTC組織，分別切取PTC組織及甲狀腺組織行冰凍切片檢查，連續切片3 張，切片厚度為5 μm，行蘇木素-伊紅染色。另分別切片行冰凍免疫組織化學染色，選取抗體為CK19，試劑盒由上海賽諾特生物技術有限公司提供。免疫組織化學染色具體步驟為：1）將冰凍切片粘附載玻片上，中性福爾馬林固定5 s，PBS沖洗10 s；2）用封閉劑封閉2 min，PBS沖洗20 s；3）滴加一抗CK19 10 μL，37 ℃溫箱孵育3 min，PBS沖洗3 次；4） 滴加二抗10 μL，37 ℃溫箱孵育3 min，PBS沖洗3 次；5）高敏DAB顯色，觀察顯色情況，用自來水沖洗，終止顯色；6）用蘇木精復染15 s，流水沖洗，封片。CK19 陰陽性判讀標準：細胞胞漿出現棕黃色判讀為陽性，反之則為陰性。

1.2.2 實時熒光定量PCR 采用實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）測定受試者甲狀腺組織miR-221-3p表達水平。收集PTC和正常甲狀腺新鮮組織，液氮凍存，稱取80 g PTC組織和正常甲狀腺組織，Trizol試劑盒（Life Technologies，美國）提取組織中總RNA，測定RNA純度和濃度。取1 μg RNA 經miRNA First Strand Synthesis Kit試劑盒（大連寶生物工程有限公司，中國）逆轉錄成cDNA。采用SYBR green染料法，內參基因U6，經miR-X miRNA qRT-PCR TB Green Kit試劑盒（大連寶生物工程有限公司）定量檢測miR-221-3p表達水平，每例樣本均設置3 個復孔。反應條件：95 ℃預變性10 s，95 ℃ qRT-PCR 5 s，60 ℃延伸20 s，共40 個循環。采用2-△△Ct法計算miR-221-3p相對表達水平。引物序列由上海生工生物有限公司合成（表1）。

表1 引物序列

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 PTC 組織與正常甲狀腺組織CK 19 表達情況

本研究中，26 例PTC組織及23 例正常甲狀腺組織均行術中冰凍免疫組織化學染色，所選免疫標記為CK19，26 例PTC組織CK19 表達均為陽性，23 例正常甲狀腺組織CK19 表達均為陰性（圖1）。

圖1 CK19 在PTC組織和正常甲狀腺組織中的表達情況

2.2 PTC 組織與正常甲狀腺組織中miR-221-3p 相對表達量比較

PTC組織中miR-221-3p相對表達量高于正常甲狀腺組織（P＜0.05）（表2）。

表2 PTC組織與正常甲狀腺組織中miR-221-3p相對表達量比較

2.3 不同臨床病理特征PTC 患者miR-221-3p 表達水平比較

比較不同性別、年齡、腫瘤直徑和腫瘤病灶數的PTC患者miRNA-221-3p表達水平，差異無統計學意義（P＞0.05）；淋巴結轉移的PTC患者腫瘤組織中miR-221-3p 表達水平高于無淋巴結轉移PTC患者（P＜0.05）（表3）。

表3 不同臨床病理特征PTC患者miR-221-3p表達水平比較

2.4 PTC 患者淋巴結轉移危險因素分析

多因素Logistic回歸分析，采用向前似然比法，引入變量標準為α入=0.05，剔除標準為α出=0.10。以PTC患者淋巴結轉移情況為因變量，結果顯示，miR-221-3p自變量的OR值22.761，說明PTC患者發生淋巴結轉移中miR-221-3p高表達優勢比是低表達的22.761 倍，為危險因素；病灶數目和年齡雖優勢比OR＞1，但陽性結果發生的條件概率差異無統計學意義（P＞0.05），這可能因病例樣本量偏少引起。由此可見，miR-221-3p高表達為PTC患者發生淋巴結轉移的主要危險因素（表4）。

表4 PTC患者淋巴結轉移危險因素分析

3 討論

PTC是一種起源于甲狀腺濾泡細胞的惡性腫瘤，近年來發病率持續增高，女性發病率遠高于男性，且在疾病早期約有10%～15%的患者可以發生遠處轉移[7]。是否發生淋巴結轉移是PTC手術治療及預后的重要判斷依據之一。雖然現代超聲影像技術、細胞病理技術高度發展，但超聲TI-RADS分級診斷系統對4 級以上結節的惡性可能性評估范圍跨度較大（5%～100%）[8]，細針穿刺細胞活檢也依然存在因大小、部位、距體表距離而造成淋巴結轉移證據漏診或不精準的情況[9]。所以，尋找新型分子標志物用于診斷、術前評估和預后治療顯得尤為重要。術中冰凍免疫組織化學染色技術應用于術中冰凍腫瘤標本，基于抗原抗體相結合的原理而出現快速高效的染色方法，已經成為病理輔助診斷較為常用的染色方式，再結合蘇木素-伊紅染色可大大提高病理學對腫瘤性質、類型、來源等快速診斷的能力[10-11]。CK19 是上皮細胞分泌的一種糖蛋白，分子量為40 kDa，免疫組織化學染色中主要用來標記單層上皮，在鑒別甲狀腺各種腫瘤類型方面具有較高的靈敏度和特異性[12-15]，尤其是結合蘇木素-伊紅染色技術后對PTC診斷更為精準，為本研究選擇術中免疫組織化學染色抗體提供了理論依據。

miRNAs是一種長度約為22 個核苷酸、無蛋白編碼能力的調節分子，其介導的調控是真核生物中最廣泛的轉錄后調控機制之一，可能調控超過30%的哺乳動物基因產物，參與了細胞增殖、分化、凋亡甚至器官形成等重要生命活動[16-17]。miR-221-3p 編碼基因位于Xp11.3 染色體，并且在宮頸癌、肝癌、結腸癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤中異常上調表達[18-20]。本研究發現，PTC組織中miR-221-3p表達高于正常甲狀腺組織，提示PTC患者miR-221-3p高表達，進一步納入臨床病例特征，通過Logistic多因素分析得出，miR-221-3p高表達為PTC患者發生淋巴結轉移的獨立危險因素。

綜上所述，本研究根據PTC具有發病率高、早期易出現遠處轉移的特點，采用術中冰凍診斷結合冰凍免疫組織化學染色的方法，極大提高了術中診斷PTC的準確性，避免患者因診斷不清再次手術所帶來的創傷。術后通過分子生物學方法檢測確定了PTC轉移的獨立危險因素，對患者的預后評估及治療均提供了有效的檢測手段。