豬源葡萄球菌的分離與鑒定

楊江宇 焦海宏 肖 靜 萬金隆

(1 塔里木大學動物科學與技術學院，新疆阿拉爾 843300；2 兵團南疆動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆阿拉爾 843300）

1 前言

葡萄球菌病是由葡萄球菌引起的人和動物多種疾病的總稱，如皮膚的化膿性炎癥、菌血癥、敗血癥和各種內臟器官的嚴重感染。豬源葡萄球菌感染仔豬會引起滲出性皮炎，同時也叫“豬油皮病”，是一種仔豬急性接觸性傳染病。該菌常寄居于皮膚、黏膜上，當動物機體的抵抗力低下或皮膚、黏膜等破損時，病菌便乘虛而入，滲出性皮炎是該病菌引起豬發病的主要癥狀[1]。一旦仔豬感染葡萄球菌病，不僅會出現皮膚感染，還會影響身體的正常生長發育，嚴重的導致死亡。

1.1 病原

豬源葡萄球菌是微球菌科葡萄球菌屬的一群革蘭氏陽性球菌，是一種圓球形、無鞭毛、無莢膜、不能運動、無芽孢的病原菌，該病原菌對培養基要求不高，普通培養基上可正常生長；在含血液瓊脂固體培養基上生長成表面光滑、邊緣濕潤、圓形無溶血環的菌落；肉湯培養基上生長成渾濁菌落；在麥康凱培養基上無法良好生長。該病原菌對環境要求不嚴格，具有良好的耐受力，在pH 值4.5～9.0 的環境中，均能生長，生長最適溫度為37℃左右，加熱至80℃30 min 才能殺滅，瞬間殺滅需要加熱至100℃，該菌在干燥膿汁內可存活20～80 d[2]。

1.2 流行病學

葡萄球菌在自然環境中分布極為廣泛，在空氣、土壤、食物、污水、塵埃中都有存在，也是人和動物體表及上呼吸道的常駐菌。仔豬感染豬源葡萄球菌的因素很多，如飼養管理與飼養圈舍的環境、飼養工具、豬群免疫力等[3]。葡萄球菌主要危害5～10日齡的乳豬，其次是斷奶仔豬，在急性期的發病率可高達100%，死亡率達70%～100%，一年四季都可能發生，但是發病最多的是在夏季和秋季溫暖潮濕的季節，沒有明顯的地域特征，傳播途徑主要通過豬與豬之間的接觸感染，在母豬的皮膚和耳朵等處隱藏的細菌為主要的傳染源[4,5]。因為發病率和致死率極高，所以給我國規?；B豬業造成嚴重的經濟損失[6]。

1.3 臨床癥狀和病理變化

感染葡萄球菌的豬發病初期皮膚紅腫，滲出粘稠的液體，形成結痂，有一股惡臭，呈橫紋龜裂，用力將痂皮剝掉，露出紅色的傷口，里面有粘稠的液體和膿性分泌物的紅色創面，隨著病程延長，在傷口上會形成一塊塊黑色紐扣狀結痂[7]。病豬眼結膜蒼白，眼部水腫，病變結痂揭開后可暴露鮮紅色創面，創口皮膚濕潤，黏膜漿性膿液，病豬體表淋巴結體積變大，并出現腫脹和出血，肝臟、腎臟、脾臟等組織腫脹，輸尿管體積變大，并有細胞碎片，部分病豬腎臟淤血，腎盂內有許多化膿病灶，呈黃豆粒狀。病豬胃腸空虛，部分病豬腹腔內有化膿性病灶[8]。

1.4 分離鑒定豬源葡萄球菌的目的和意義

采集阿克蘇地區某豬場3 只患病豬的病料，對其進行細菌培養、形態學觀察、生化試驗以及藥敏試驗和PCR 測序，分離出豬源葡萄球菌。近年來，滲出性皮炎的危害雖然未達到嚴重影響生產的程度，但在某些豬場已成為一個嚴重問題，也已成為豬的一種常見病。該病通常呈散發性，豬一旦感染該病，其藥物的治療效果較差，病死率仍較高，導致養豬業發生嚴重的經濟損失[9]。我國豬滲出性皮炎發病率增多已是客觀存在，研究和關注該病的病原、流行病學及發病機理對其防治具有重要意義。

2 試驗材料

2.1 試驗動物

本試驗材料來源于新疆阿克蘇地區某豬場，從保育舍挑選典型病例活豬3 頭。

2.2 試驗儀器與試劑

GSP 9080WBE 型隔水式恒溫培養箱由上海博訊實業有限公司生產，CX31 數碼生物顯微鏡由上海尼康儀器有限公司生產，C1000 Touch PCR 儀由Bio-Rad 中國公司生產，DYY12 型電泳儀由北京六一儀器廠生產，Pico17 型高速離心機由賽默飛世爾科技有限公司生產，C1000 TouchTM 型全自動凝膠成像分析儀由Bio-Rad中國公司生產。

胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）由Solarbio 生產，LB 瓊脂由青島高科技工業園海博生物技術有限公司生產，革蘭氏染色試劑由上海生物工程有限公司生產，DL2000 Marker 由北京天根生化科技有限公司生產，細菌16S rRNA 通用引物（27F,1492R）由上海生物工程技術服務有限公司合成，細菌基因組DNA 提取試劑盒由北京天根生化科技有限公司生產，核酸染液GelvlewI 由上海生物工程技術服務有限公司生產，藥敏紙片由杭州微生物試劑有限公司生產。

3 試驗方法

3.1 剖檢采樣

無菌條件下采集病豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織，劃線接種于培養基上培養。同時，將組織樣品-80℃保存備用。

3.2 分離培養

配制TSB 固體培養基、5% LB 綿羊血平板培養基和TSB 液體培養基備用。把采集好的病料放入操作臺中，做好無菌防護。把采集的病料用刀切下一塊，用高溫灼燒冷卻后的接種環從切面直接插入病料組織中，抽出后用三線法接種于TSB 培養基和5% LB 綿羊血平板培養基上，在37℃恒溫箱中培養10 h，觀察第1 代培養菌在培養基上的生長情況。用革蘭氏染色鏡檢，觀察細菌的顏色、大小、形態[9]，再用接種環挑取固體培養基上的菌落接種于TSB 培養基和5% LB 綿羊血平板培養基上進一步純化培養，鏡檢觀察第2 代培養菌。取純化后的菌落接種于TSB 液體培養基上，通過37℃搖床增菌，然后革蘭氏染色鏡檢，即可得到純化的第3 代培養菌。

3.3 形態學觀察

固體培養基上形態學觀察，選擇干凈滅菌的載玻片，往載玻片上滴1 滴蒸餾水備用，用高溫滅菌后的接種環在培養基上挑選生長情況良好的菌落蘸取其一半，于蒸餾水中稀釋，用火焰固定法固定，然后用革蘭氏染色法進行染色，結晶紫1～2 min、碘液1～3 min、酒精30～60 s、復紅染液15～30 s，自然風干后用顯微鏡觀察其顏色、形態、大小、結構。液體培養基形態學觀察，取出純化的菌液放入操作臺中，選擇干凈的載玻片備用，用移液槍取10 μL 菌液放入載玻片上，用滅菌的接種環順時針旋轉抹開，用火焰法固定，然后用革蘭氏染色法進行染色，風干后顯微鏡下觀察，與固體培養基上的細菌進行對比。

3.4 生化試驗

嚴格按照無菌操作，在無菌操作臺上進行。準備好葡萄球菌生化試驗所需要的微量生化鑒定管、山梨醇、木糖、葡萄糖蛋白胨水（VP）、尿素、葡萄糖產氣、硫化氫等，將分離好的純種菌液用移液槍取50 μL 分別接種于微量生化管中，用封口膜密封好放于37℃的恒溫培養箱培養12 h，即可取出觀察。VP 試驗的葡萄糖蛋白胨水微量管取出后還需要先加入VP 試劑甲液3 滴，再加VP 試劑乙液1 滴，然后再放回恒溫培養箱中培養4 h取出觀察結果。

3.5 分子生物學鑒定

3.5.1 DNA 提取

⑴取菌液300 μL 于200 mL 離心管中，加入DNA zol 700 μL，顛倒3 次使其混勻然后靜置5 min，放入離心機中12 000 rpm 離心10 min；

⑵取上清液800 μL，加入到新的2 mL 離心管中；⑶再加入500 μL 無水乙醇，顛倒混勻5 次，靜置3 min，放入離心機7 500 rpm 離心3 min 棄上清液；

⑷加入800 μL 75%無水乙醇，顛倒混勻，放入離心機12 000 rpm 離心5 min 棄上清液；

⑸重復第（4）步；

⑹開蓋靜置使無水乙醇揮發；

⑺加入40 μL 8 mM 的NaOH，用移液槍重復稀釋混勻即可得到提取的DNA；

⑻過夜保存放入4℃冰箱，長期保存放入-20℃冰箱。

3.5.2 PCR

檢測16S rRNA 的擴增所需反應體系及反應條件[10]，見表1、表2。

表1 PCR 反應體系

表2 PCR 反應條件

3.5.3 電泳

⑴制作凝膠：稱取0.5 g 瓊脂糖，倒入50 mL（1×TAE）緩沖液，放入微波爐加熱2 min，待其完全溶解再次加熱至清澈透明無沉淀；選擇大小合適的齒梳插入膠板中卡好，備用；靜待瓊脂糖溶液冷卻1 min 后加入5 μL 核酸染液充分混勻；倒入制膠板中，確認凝膠中無氣泡或無異物，等待15～30 min 凝固后拔出梳子[11]。

⑵點樣：第一個泳道加入DL2000 marker，其余泳道加PCR 產物，最后一個泳道加空白對照；

⑶把點樣好的凝膠板放入DYY12 型電泳儀中30 min；

⑷電泳瓊脂糖凝膠板放入C1000 TouchTM 型全自動凝膠成像分析儀進行觀察；

⑸把擴增所得基因片段送測序公司進行測序。

3.5.4 測序及序列比對

把測序的基因片段，用數據庫NCBI 的序列進行同源性比對。

3.6 藥敏試驗

采用藥敏紙片擴散法進行藥敏試驗，嚴格按照無菌操作，在無菌操作臺上進行。首先選好該試驗所需要的藥敏紙片：氧氟沙星、慶大霉素、萬古霉素、環丙沙星、頭孢唑啉、紅霉素、克林霉素、頭孢他啶、新霉素、青霉素、四環素、林可霉素[12]。選擇3 個BD 培養基，用移液槍取100 μL 分離好的葡萄球菌菌液接種于BD 培養基上，然后用高溫滅菌后的涂布棒均勻涂布（必須均勻涂布不然會影響試驗結果），涂布均勻后，在培養基上選擇4 個適當位置放上藥敏紙片（放藥敏紙片的時候按壓一下以防脫落），放好紙片后，把培養基放入37℃恒溫培養箱中培養18～24 h 取出，用游標卡尺測量抑菌圈直徑即可。結果判定參照美國實驗室標準委員（NCCLS）推薦的規定進行判斷，即抑菌圈直徑＞20 mm 為極敏，在15～20 mm 之間為高敏，在10～14 mm 之間為中敏，＜10 mm 為低敏，無抑菌圈為耐藥[13,14]。

4 結果

4.1 剖檢結果

體表觀察有劃水現象、呼吸急促、喘氣、站立困難、精神萎靡不振、眼結膜蒼白、消瘦、口鼻眼有黏液、皮膚各處有創傷結痂、皮膚外表泛紅呈紅斑、前肢肘關節處有許多透明小水泡，如下圖1。

圖1 病豬體表觀察

肝臟色澤不均一、有淤血，部分肝臟顏色偏黃、部分肝臟顏色呈暗紅色、質地實，切開肝臟，血液顏色偏黑紅，膽囊腫大、膽汁顏色為藍綠色，肺臟質地實而硬、顏色不均一、有大面積出血塊。肺葉外緣蒼白無色。心臟心包膜與心臟分離明顯、心臟顏色偏灰白。脾臟上有白色結節、有水泡、顏色偏灰紫。腎臟色澤不均一、有散狀出血斑、腎乳頭呈灰白色、腎盂有膿性分泌物（尿酸鹽沉積）。有些腸段鼓氣、空虛、透明、充血，有些腸段內含有暗褐色的比較干硬的圓球狀內容物，腸系膜出血嚴重、血管明顯腫大。胃中黏液增多、有黃色液體殘渣、出血嚴重。

4.2 分離培養及染色鏡檢結果

4.2.1 分離培養結果

將病料組織液接種于TSB 培養基和5%綿羊血平板培養基上培養10 h，發現TSB 培養基表面長有圓形、不透明、表面隆起、光滑、圓珠狀菌落，直徑1.0～2.0 mm；5%綿羊血平板培養基表面長有圓形、乳白色、針尖狀菌落、稍粘、無溶血環。

4.2.2 鏡檢觀察結果

用革蘭氏染色法進行染色觀察，發現菌體呈藍紫色，菌株屬于革蘭氏陽性菌，其形態特征主要為雙球或短鏈狀排列或數個球狀細菌串聯成葡萄狀，可將其初步判定為豬源葡萄球菌。

4.3 生化試驗結果

生化鑒定結果見表3，7 株生化試驗結果一樣，均符合豬源葡萄球菌的生化特性。

表3 生化試驗結果

4.4 PCR 檢測結果

用顯微鏡觀察得到的7 個樣本葡萄球菌基因組作為模板，一個空白對照，用PCR 法對16S rRNA 基因序列進行擴增，通過電泳30 min，用C1000 TouchTM 型全自動凝膠成像分析儀進行觀察，該試驗菌株16S rRNA基因PCR 產物的大小約為1 500 bp，與預期片段大小基本符合，而且陽性對照和陰性對照結果成立。

進一步送北京測序公司測序得到7 株細菌基因片段，用數據庫NCBI 的序列進行多重比對，得出結果為分離出來的菌株DNA 與葡萄球菌的核苷酸同源性高為99.93%，由此推斷本試驗獲得的菌株為豬源葡萄球菌。

4.5 藥敏試驗結果

采用藥敏紙片擴散法檢測分離菌株對不同抗生素藥物的敏感性，試驗結果如表4所示，分離菌株對抗生素氧氟沙星、環丙沙星、頭孢唑啉、萬古霉素、新霉素高度敏感；對青霉素、四環素、克林霉素、頭孢他啶中度敏感；對慶大霉素、林可霉素、紅霉素產生耐藥。

表4 分離菌株耐藥性分析

5 討論

本試驗為了分離豬源葡萄球菌，從阿克蘇某豬場挑選3 頭疑似葡萄球菌感染的患病仔豬。通過解剖觀察內臟病變情況，發現病變明顯的部位主要有腸、脾臟、肝臟、肺臟和膽囊，實驗室細菌分離培養及革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌落顏色、形態、大小，初步判斷分離得到葡萄球菌；然后通過生化試驗鑒定和PCR 測序結果得出7 株與豬源葡萄球菌的同源性達99.93%的菌株。藥敏試驗顯示該菌株對慶大霉素、青霉素、四環素、林可霉素、紅霉素、克林霉素、頭孢他啶均有耐藥性，而對頭孢唑啉、萬古霉素、氧氟沙星、環丙沙星、新霉素表現敏感；頭孢唑啉、新霉素與查找資料中標準抗菌譜結果存在差異[15]，病菌應該對該2 種抗生素產生低敏和耐藥性，但在試驗中卻對其表現高敏性。此外，其他文獻報道葡萄球菌對克林霉素、慶大霉素及四環素敏感性較高，但本試驗的菌株對以上3 種抗生素卻產生低敏和耐藥性[16]。通過了解發現，3 頭病豬在豬場治療時使用的抗生素為慶大霉素和四環素，可能是由于該原因導致病菌發生變異，對藥敏試驗結果造成一定影響。病豬臨床癥狀的不明顯和解剖病變結果的差異也可能是由于病豬在豬場接受治療所引起。由此可推斷該3 頭患病仔豬是由葡萄球菌和其他病菌共同感染所致。

6 結論

本試驗從3 頭病豬料中分離出7 株豬源葡萄球菌，通過細菌分離培養、形態學觀察、生化試驗、PCR 檢測都與豬源葡萄球菌性狀一致。最后進行藥敏試驗，結果顯示，該菌對氧氟沙星、環丙沙星、頭孢唑啉、新霉素高度敏感，對青霉素、四環素、克林霉素、頭孢他啶中度敏感，對慶大霉素、林可霉素、紅霉素耐藥。