仔豬副豬嗜血桿菌的分離鑒定及耐藥性檢測

陳新湖

(湖南省衡陽市祁東縣金橋鎮農業綜合服務中心，湖南衡陽 421600）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,Hps）為臨床中常見的條件性致病菌之一，該菌廣泛存在于自然界的養殖環境中，還存在于豬的上呼吸道中，尤其是在養豬過程中，如果飼養管理不當、應激（如天氣驟變、轉群、運輸）等導致豬的免疫力下降，容易引發副豬嗜血桿菌病[1-3]。副豬嗜血桿菌具有多種血清型，可以感染不同階段的豬只，尤其是對4～8 周齡的仔豬最易感，其感染率和死亡率均較高，臨床中以呼吸困難、纖維素性胸膜炎、肺炎及關節炎等多種癥狀最常見，經常與免疫抑制性疾病如豬圓環病毒病、豬瘟、豬藍耳病等混合感染，可以導致豬的高感染率和高死亡率[4-7]。仔豬副豬嗜血桿菌病在世界多個國家和地區流行，該病已經成為危害養豬業的重要細菌性傳染病之一[8-10]。國內外相關研究表明，仔豬副豬嗜血桿菌病主要通過抗生素進行治療，由于該病流行廣泛，其耐藥性已經普遍存在且呈現逐年增高的趨勢，細菌的耐藥性給臨床用藥帶來了一定困難，同時抗生素的使用也危害著人們的健康，藥物殘留已成為公共衛生安全的主要問題[11-12]。本試驗對采集患病仔豬病料樣品進行Hps 分離鑒定，并檢測副豬嗜血桿菌的致病性和耐藥性，以期為該地區仔豬Hps 合理用藥提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 菌株來源

2021年采集的衡陽祁東地區不同規?；B豬場及散養戶中患呼吸道病死仔豬口鼻拭子、胸腔積液、肺臟等病料組織187 份，將采集的樣品進行處理后，進行副豬嗜血桿菌的分離鑒定。

1.2 細菌分離與培養

將采集的樣品進行處理后，在無菌條件下，接種于巧克力培養基上，在厭氧環境條件下（5% CO2培養箱中）37℃恒溫培養12～18 h 后，挑取單個菌落接種于TSB 培養基上進行純化培養，37℃培養12～18 h，進行革蘭氏染色、鏡檢觀察其形態學。

1.3 衛星現象檢測

參照王同兆等[13]報道的方法，將純化的分離菌株在無菌條件下接種于7%脫纖綿羊血平板上，再在7%脫纖綿羊血平板上的中心進行垂直劃線接種金黃色葡萄球菌標準菌株（CVCC2523），在厭氧環境條件下（5% CO2培養箱中）37℃恒溫培養24～48 h 后，觀察7%脫纖綿羊血平板上分離菌株的菌落是否有衛星菌落生長與溶血現象。

1.4 細菌PCR 鑒定

參考王慶云[14]的研究方法，設計鑒定副豬嗜血桿菌所需的引物，在華大基因合成引物（表1）。采用煮沸法提取具有衛星菌落現象的分離菌株的基因組，并進行PCR 鑒定?；厥誔CR 產物，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序與比對。

表1 引物序列

1.5 致病性試驗

參考王麗榮等[15]的方法，將分離菌株接種于營養肉湯中，培養至對數期調整菌液濃度為109CFU/mL，每株分離菌株經腹腔注射給5 只昆明系小鼠，劑量為0.5 mL/只（109CFU/mL），對照組小鼠注射等量的無菌生理鹽水。試驗期7 d，觀察小鼠的發病情況。

1.6 藥敏試驗

分離菌株的藥敏試驗參照美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）2013年推薦的藥敏試驗法標準進行操作與結果判定。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養

疑似副豬嗜血桿菌的菌株通過巧克力培養基、TSB培養基培養及鏡檢，觀察其形態學結果（圖1），均符合副豬嗜血桿菌的培養特性和形態學。

圖1 分離菌株革蘭氏染色（1 000×）

2.2 衛星現象檢測

將純化的分離菌株在無菌的條件下接種于7%脫纖綿羊血平板上，進行副豬嗜血桿菌衛星現象檢測。結果顯示，分離菌株生長狀態良好，出現了典型的“衛星現象”，分離菌株沒有出現溶血現象（圖2）。

圖2 分離菌株的衛星現象

2.3 細菌PCR 鑒定

對出現了典型“衛星現象”的分離菌株進行PCR鑒定。結果顯示分離的78 株分離菌株均擴增出大約為821 bp 的目的條帶（圖3）。經序列對比78 株分離菌株與參考株（副豬嗜血桿菌）的同源性均大于97.9%，說明分離株為副豬嗜血桿菌，分離率為41.7%（78/187）。

圖3 分離的副豬嗜血桿菌菌株PCR 鑒定結果

2.4 致病性試驗

攻毒組小鼠在攻毒后2～3 d 出現了不同程度的發病，且個別攻毒的小白鼠不表現任何癥狀，而出現急性死亡，剖檢死亡小鼠可見其肺臟、肝臟、腎臟、脾臟出現了不同程度的出血。通過病料組織分離培養，得到了副豬嗜血桿菌，攻毒試驗結束對照組小鼠健康存活。經統計，50 株副豬嗜血桿菌能引起小白鼠的死亡，且分離出的菌株均為致病性副豬嗜血桿菌。

2.5 藥敏試驗

由表2 可知，分離的50 株致病性副豬嗜血桿菌對青霉素、阿莫西林、氨芐西林等8 種藥物的耐藥率為44.0%～50.0%，對頭孢噻呋、頭孢噻肟、替米考星等6種藥物的耐藥率為4.0%～44.0%；說明臨床中分離的50 株致病性副豬嗜血桿菌對常用的治療豬呼吸系統疾病的藥物有不同程度的耐藥性。

表2 藥敏試驗結果

3 討論

副豬嗜血桿菌為養豬業常見的條件性致病菌，該菌廣泛存在于養殖環境中和健康豬只的體內，可以通過多種途徑（直接接觸傳播、空氣傳播、飼料飲水傳播等）在不同豬只之間傳播[2]。副豬嗜血桿菌病可引起豬只發病，急性病例呈現呼吸困難、急性敗血癥等，具有發病比較急、死亡率較迅速等特點，為養豬業中常見的急性、敗血性疫病[6]。近年來，關于仔豬副豬嗜血桿菌病的報道越來越多，尤其對仔豬的危害較大，同時在臨床中，常常發現與其他致病菌（毒）混合感染。本試驗從衡陽祁東地區不同規?；B豬場及散養戶中采集的187 份病料樣品中，分離到50 株致病性副豬嗜血桿菌，說明副豬嗜血桿菌在該地區豬場中流行嚴重，可能對仔豬存在潛在危害性，尤其豬場應注意副豬嗜血桿菌病的防控，同時注意環境衛生，加強飼養管理，注意對該菌進行合理疫苗免疫。

臨床中，仔豬副豬嗜血桿菌主要通過抗菌藥物進行防治，隨著抗菌藥物的不合理使用、甚至濫用，導致細菌對部分抗菌藥物產生較強的耐藥性，且耐藥性菌株不斷出現，同一地區不同養殖場，其細菌的耐藥性也存在差異性，嚴重影響藥物對該病的治療效果[7,10,11,14]。因此，在臨床中治療該病時，應做好藥敏試驗，選擇對副豬嗜血桿菌敏感的藥物進行交替使用，同時應該配合環境消毒。

4 小結

從采集的187 份病料樣品中分離到了50 株致病性菌株副豬嗜血桿菌，50 株致病性副豬嗜血桿菌對青霉素、阿莫西林、氨芐西林等8 種藥物的耐藥率在44.0%～50.0%之間，對其他藥物的耐藥率為4.0%～44.0%，為該地區仔豬副豬嗜血桿菌病的合理用藥及防控提供參考。