連云港市新型冠狀病毒感染者恢復期中和抗體和部分生化指標分析

朱曉露,徐夢蝶,李海朋,卞光玲,路靜,王一力,趙興

1.連云港市疾病預防控制中心,江蘇 連云港 222000;2.連云港市海州區疾病預防控制中心

新型冠狀病毒感染為新發傳染病,恢復后可引發系列后遺癥,如嗅覺障礙、Ⅱ型糖尿病[1]、腎臟疾病[2]、心力衰竭和中風[3]等。感染者恢復后身體狀況的持續監測,對更好地理解新冠病毒感染的致病程度具有重要的價值。本研究通過對感染者恢復期1.5年內的血清隨訪檢測結果進行分析,通過觀察感染者中和抗體和部分生化指標的動態變化趨勢,探究新冠病毒感染后的機體恢復情況,為更好地研究新冠病毒感染后人群的恢復狀況提供實驗室數據。

1 材料和方法

1.1 對象 2020年1—3月連云港市本地新冠病毒感染者82例,在知情同意的情況下,對56例恢復期感染者進行采樣召集,分別在2020年8月、2021年4月、2021年10月進行恢復期0.5、1、1.5年的咽拭子和血清采集,共125份,其中3份血清均完整采集25例。以此25例為本研究對象。本研究通過倫理學審查。

1.2 主要儀器與試劑 儀器: QuantStudio 7 Pro熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystens),全自動核酸提取儀(江蘇碩世),酶標儀(安圖),洗板機(賽默飛世爾),醫用離心機(新時代北利醫療)。試劑:人總蛋白試劑盒(ELISA法,研科生物),人D-二聚體試劑盒(ELISA法,研科生物),人降鈣素原試劑盒(ELISA法,研科生物),人C-反應蛋白試劑盒(ELISA法,研科生物),新冠病毒中和抗體檢測試劑盒(ELISA法,上海捷諾生物),新冠檢測試劑(熒光PCR法,上海伯杰),核酸提取試劑(磁珠法,江蘇碩世),所有試劑均在效期內使用。

1.3 方法

1.3.1 核酸檢測 樣本核酸提取依據碩世試劑說明書進行,采用樣本核酸5 μL。采用新冠病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒(熒光PCR法,上海伯杰)在QuantStudio 7 Pro熒光定量PCR儀上檢測新冠病毒(N基因,ORF1ab基因);循環參數設定:50℃逆轉錄10 min;95℃預變性5 min;95℃變性10 s,55℃延伸40 s,45個循環。每次循環55℃熒光檢測,檢測通道FAM(ORF1ab),VIC(N基因),ROX(內參),淬滅基團None。

1.3.2 人總蛋白和部分生化檢測 ①從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余半條用自封袋密封放回4℃。②設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL,樣本孔加入待測樣本50 μL,空白孔不加;③除空白孔外,標準品孔和樣本孔中各加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100 μL,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋溫育60 min;④使用洗板機進行洗板,棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液(350 μL),靜置1 min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板5次。⑤每孔加入底物A、B各50 μL,37℃避光孵育15 min;⑥每孔加入終止液50 μL,15 min內在450 nm波長處測定各孔的OD值。

1.3.3 中和抗體檢測 ①質控品、標準品及樣本加樣:將準備好的質控品、校準品和樣本,按照順序依次加入微孔板A中,每孔加入20 μL。之后加入100 μL RBD蛋白并混勻,用膜封閉微孔反應板A置于37℃微孔板恒溫振蕩器孵育30 min。②與ACE2反應:于混合均勻的微孔反應板A中吸取100 μL的混合物,加入微孔反應板B中,封膜后置于37℃恒溫振蕩器孵育1 h。③洗板:甩盡微孔反應板B中的液體,洗滌液注滿各孔,約加入350 μL洗滌液靜置10 s,甩盡孔里的液體,在吸水紙上拍干,以上步驟反復5次。④酶標抗體:微孔反應板B每孔加入100 μL酶標抗體,封膜后于37℃微孔板恒溫振蕩器孵育30 min。⑤洗板:步驟同③。⑥顯色:每孔加入100 μL底物,封膜后于37℃微孔板恒溫振蕩器避光孵育15 min。⑦終止:每孔加入100 μL終止液,15 min內完成讀數。⑧測定OD值:用酶標儀讀數,測量波長450 nm,讀取各孔OD值。

1.4 質量控制 SARS-Cov-2嚴格按照《新型冠狀病毒肺炎防控方案(第七版)》執行,做好三陰一弱陽對照、試劑陰陽性對照。結果判定依據:陰性對照FAM通道、VIC通道無Ct值;陽性對照(FAM、VIC、ROX通道)Ct≤30。陽性,樣本檢測Ct值≤40,曲線呈S型且明顯指數增長;陰性,樣本檢測Ct值>40或無Ct值;可疑,Ct值≤40,需重復檢測,若Ct值仍≤40,判為陽性,否則為陰性。

SARS-Cov-2人總蛋白和部分生化結果判定:以所測標準品OD值為橫坐標,標準品的濃度值為縱坐標,繪制標準曲線得直線回歸方程,將樣本的OD值帶入方程,計算出樣本的濃度。

SARS-Cov-2中和抗體檢測:使用校準品濃度(X軸)相對于校準品1-6的吸光度值(Y軸)繪制標準曲線。擬合方法是四參數Logistic函數,將樣本的OD值帶入方程,計算出樣本的濃度。中和抗體<6.25 IU/mL則報告為<6.25 IU/mL;中和抗體>100 IU/mL則需要使用稀釋液稀釋后重新測定。

1.5 統計分析 采用Excel 2007整理數據,SPSS 19.0軟件統計分析,計量資料采用方差分析(兩兩檢驗采用配對設計的t檢驗),中和抗體滴度數值取對數值進行分析,檢驗水準:α=0.05。

2 結果

2.1 基本情況 25名新冠病毒感染者,男8例,女17例,職業為離退人員9例、家務及待業8例、干部職員4例、教師或工人2例、其他2例;感染毒株均為新冠病毒原始株,年齡最大75歲,最低23歲,中位數為52歲;確診病例13例,無癥狀感染者12例;確診病例(輕型和普通型)平均住院(23.54±5.53)d,無癥狀感染者為(16.83±8.33)d,差異有統計學意義(t=2.35,P<0.05)。所有病例均順利出院,出院后至監測結束均無疫苗接種史。

2.2 核酸隨訪結果 25例新冠病毒感染者恢復期3次咽拭子標本采集,經檢測SARS-Cov-2核酸均為陰性。

2.3 中和抗體變化情況 25例感染者恢復期0.5、1、1.5年,新冠病毒中和抗體滴度分別為(2.05±0.57)、(1.98±0.61)、(2.40±0.53) IU/mL,差異有統計學意義(F=3.73,P<0.05);其中恢復期1.5年中和抗體滴度最高,恢復期0.5年其次,恢復期1年最低,兩兩比較差異均有統計學意義(t0.5～1.5年=4.43,t0.5～1年=2.85,t1～1.5年=5.48,P值均<0.05)。按照疾病程度劃分,3個時間段的平均中和抗體滴度,確診病例組(2.28±0.58)IU/mL高于無癥狀感染者組(1.99±0.57)IU/mL,差異有統計學意義(t=72.65,P<0.05)。

2.4 人總蛋白和部分生化指標變化情況 檢測的人總蛋白、人C-反應蛋白、D-二聚體、人降鈣素原,在恢復期0.5、1年、1.5年其濃度差異均有統計學意義(F=73.20、42.73、42.39、56.21,P值均<0.05)。見表1。

表1 25名新冠病毒感染者不同恢復期部分生化指標檢測結果

兩兩比較,人總蛋白恢復期0.5年高于恢復期1年、恢復期1.5年,差異均有統計學意義(t=11.58、9.73,P值均<0.05),恢復期1年與恢復期1.5年間差異無統計學意義(t=0.31,P>0.05);人C-反應蛋白恢復期1年低于恢復期0.5年、恢復期1.5年,差異均有統計學意義(t=14.55、9.53,P值均 <0.05),恢復期0.5年和恢復期1.5年差異無統計學意義(t=1.65,P>0.05);D-二聚體恢復期1年低于恢復期0.5年、恢復期1.5年,差異均有統計學意義(t=9.85、12.65,P值均<0.05),恢復期0.5年和恢復期1.5年間差異無統計學意義(t=0.47,P>0.05);人降鈣素原恢復期1.5年高于恢復期0.5年、恢復期1年,差異均有統計學意義(t=2.22、13.182,P值均<0.05);恢復期0.5年高于恢復期1年(t=11.52,P<0.05)。

3 討論

本研究對新冠病毒感染者進行了1.5年隨訪,3次咽拭子核酸檢測結果均為陰性,此項監測指標是為了有助于復陽病例的早發現,也避免了因項目的開展增加高風險人群聚集傳播的風險。在3個監測時間點,中和抗體滴度存在明顯差異,恢復期0.5年、恢復期1.5年均高于恢復期1年,其產生的原因是否是因為IgM、IgG抗體波動變化導致尚不得而知,仍需深入隨訪探究IgM、IgG的定量動態變化以及中和抗體的長期含量波動水平。

研究表明,新冠病毒感染者重癥患者中,多數出現C反應蛋白(CRP)[4-5]和血清乳酸脫氫酶(LDH)升高,部分白蛋白( ALB)降低,降鈣素原正常,提示上述指標在病程判斷、預后判斷中可能的參考指標作用[6]。C反應蛋白升高是穩定的病毒性感染指標之一,常用于病毒感染的判定和機體抗病毒治療恢復的標識,作為體內炎癥標記物,在新冠病毒感染者或部分新冠藥物治療的副反應中均有出現[7]。開展的新冠感染者發病期、恢復期和健康人群的對照研究中發現,前兩者的血清蛋白組學發生了顯著性改變[8],但具體改變的蛋白種類尚不明確。本研究針對新冠病毒感染者的1.5年隨訪監測中,感染者的總蛋白、C-反應蛋白、D-二聚體、人降鈣素原4個指標在不同恢復期均存在變化,其恢復水平與正常人群的生化指標學差異尚不能明確,且各指標在恢復期中發揮的作用尚未可知,仍需持續的監測,探明感染者恢復到正常水平所需的時間及其具體作用。

我市新冠病毒原始株感染者恢復期1.5年內的中和抗體水平和生化指標動態監測結果表明,中和抗體水平和總蛋白、C-反應蛋白、D-二聚體、人降鈣素原等生化指標,在不同恢復期隨訪中均存在變化,感染者的預后評估尚需要持續、深入地追蹤。